人F1F0-ATP合成酶β亚基的原核表达、纯化及抗体制备  

Prokaryotic expression,purification,and polyclonal antibody generation of β subunit of human F1F0-ATP synthase

作　　者：俞丽丽[1] 张元军[2] 张霞[1] 王怡波[3] 林建波[3] 倪健[2] 彭艳[2] 

机构地区：[1]上海交通大学药学院,上海200240 [2]上海晨健抗体组药物有限公司,上海201203 [3]第二军医大学肝胆外科医院综合治疗一科,上海200438

出　　处：《细胞与分子免疫学杂志》2008年第3期253-255,259,共4页Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology

基　　金：国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2007AA02Z180);上海市科学技术委员会资助课题(054319938);浦东新区创新资金科技创业人才项目(PKR2006-16)

摘　　要：目的:原核表达、纯化人F1F0-ATP合成酶β亚基(hATP5B)并制备其多克隆抗体。方法:以人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)总RNA为模板,通过RT-PCR扩增hATP5B成熟肽编码序列,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并诱导表达,表达产物用Ni2+螯合层析纯化,纯化产物用透析复性,产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。复性产物免疫家兔,制备多克隆抗体;多抗的效价用间接ELISA法检测,并用Western blot和细胞免疫荧光分析多抗的特异性和抗原结合性。结果:测序证实获得hATP5B成熟肽编码序列。SDS-PAGE鉴定表明,表达、纯化、复性产物的相对分子质量(Mr)均约55000,与理论值相符。灰度扫描分析重组hATP5B(recombinant hATP5B,rhATP5B)的表达量占菌体蛋白总量的36.8%,纯化产物纯度达98.3%,复性产物纯度达99.2%。Western blot反应阳性。多抗的平均抗体效价为1∶640000,可特异识别HUVEC中的天然抗原。结论:原核表达的hATP5B具有良好的免疫原性,其免疫家兔后获得的多抗具有高效价和特异性。hATP5B的原核高效表达和其抗体制备为进一步研究hATP5B的功能奠定了实验基础。AIM:To express and purify the β subunit of human F1F0-ATP synthase(hATP5B)in prokaryotic system,and generate its polyclonal antibody in rabbits.METHODS:The coding sequence of hATP5B mature peptide was amplified by RT-PCR from human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)and then cloned into prokaryotic expression vector pET28a(+).The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3)to express hATP5B in reponse to IPTG induction.Expressed protein was purified by Ni2+ metal-chelating chromatograph,and refolded by...

关 键 词：hATP5B rhATP5B 原核表达 多克隆抗体 

分 类 号：R392[医药卫生—免疫学]