人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建  

Construction of a specific green fluorescent protein expression vector derived from promotor of human nucleotide-binding oligomerization domain-2 gene

作　　者：孙丽萍[1] 胡巢凤[1] 周羽竝[2] 

机构地区：[1]暨南大学医学院病理生理学教研室发热研究室,广州510632 [2]暨南大学医学院生化教研室,广州510632

出　　处：《现代免疫学》2008年第3期219-223,共5页Current Immunology

基　　金：广东省自然科学基金资助项目(06025159);广东省教育厅自然科学研究项目[粤财教(2005)126];暨南大学重点实验室基金资助项目(2006)

摘　　要：人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。To construct a specific green flurescent protein(GFP)expression vector derived from human nucleotide-binding oligomerization domain-2(NOD2) gene,4 DNA fragments of NOD2 gene promoter from human genomic DNA were amplified by PCR and correctly connected to vector pEGFP-N3 which had been cut out by restriction enzymes.Four sequences of the constructed plasmid pEGFP-N3-NOD2 were analyzed after identification with Vsp I and Pst I restriction digestion and PCR.The recombinant plasmid was transfected to cell line ...

关 键 词：NOD2启动区 载体 基因表达 

分 类 号：R392[医药卫生—免疫学]