HBSAg及B_(7-1)双表达逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达  

Construction and expression in eukaryotic cells of HBsAg and B_(7-1) coexpression retroviral vector

作　　者：周智[1] 姚集鲁[1] 张海红[1] 卢建溪[1] 陈文思[1] 

机构地区：[1]中山医科大学第三医院传染病科,广州510630

出　　处：《中华肝脏病杂志》2001年第S1期46-49,共4页Chinese Journal of Hepatology

基　　金：第26届中国博士后基金[1999]17号

摘　　要：目的为探索共刺激分子Ｂ７－ｌ增强ＨＢｓＡｇ真核表达载体基因免疫的效果，并用于消除乙型肝炎免疫耐受。方法用高保真ＰＣＲ法扩增目的基因片段Ｂ７－１及带接头和启动子的ＩＲＥＳ—ＨＢｓ基因片段，亚克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓ＋载体中测序，再克隆到逆转录病毒载体ｐｌｘｓｎ中。用脂质体转染ＰＡ３１７细胞，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。用ＮＩＨ３Ｔ３检测假病毒颗粒的滴度，并用于感染ＨｅｐＧ２、２９３、ＮＩＨ３Ｔ３细胞系，以ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｂ７－１的转录，免疫组织化学检测Ｂ７－１表达， ＥＬＩＳＡ检测细胞上清液中ＨＢｓＡｇ表达。结果所扩增的目的基因片段经测序证实，未发现序列有改变。用内切酶 ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ将 Ｂ７－１插入 ｐｌｘｓｎ中，然后用 ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ将 ＩＲＥＳ－ＨＢｓ插入构建成 ｐｌｘｓｎ－Ｂ７－１－ＨＢｓ。转染后 ＰＡ３１７ ２４ ｈ，按 １∶１０传代， ２周后共得 ４３个克隆， １∶５传代得 ９０个克隆，假病毒颗粒滴度平均为５４ × １０５ｃｆｕ／ｍｌ。 Ｂ７－１在上述细胞中均有表达。 ＨＢｓＡｇ在ＰＡ３１７、 ＮＩＨ３Ｔ３、 ＨｅｐＧ２、 ２９３细胞上清液中的含量（Ａ值）２４、 ４８、 ７２ｈ分别为０．１５、０．１１?Objective To investigate the enhanced role of B7-l in gene immunization of eukaryotic vector expressing HBsAg, and further to eliminate the immunotolerance to hepatitis B virus. Methods B7-l and IRES-HBs with linker and promoter sequence prior to HBs gene were amplified with high fidelity PCR, then subcloned into plasmid pBluescriptks+, which was used to sequence. The eukaryotic expressing vector was constructed by inserting B7-l and IRESHBs into plxsn. Recombinant vector was transfected into PA317 by mea...

关 键 词：乙型肝炎表面抗原 共刺激分子 逆转录病毒载体 

分 类 号：R512.62[医药卫生—内科学]