抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究  

Construction and cotransfection of eukaryotic expression plasmids TCR Vα6-pIRES2-EGFP and TCR Vβ13-pIRES2-EGFP specific for the DLBL associated antigen

作　　者：尹青松[1] 李扬秋[1,2] 陈少华[1] 杨力建[1] 周羽竝[1] 吴秀丽[1] 李萡[1] 张学利[1] 

机构地区：[1]暨南大学医学院血液病研究所 [2]暨南大学再生医学教育部重点实验室

出　　处：《免疫学杂志》2009年第1期1-5,11,共6页Immunological Journal

基　　金：国家高技术研究发展计划(863)(2006AA02Z114)资助;国家自然科学基金专项基金(30424003)资助;血液病学国务院侨办重点学科建设基金(51205002)

摘　　要：目的构建携带弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异性的TCR Vα和TCR Vβ基因片段的真核表达载体TCR Vα-pIRES2-EGFP和TCR Vβ-pIRES2-EGFP,将其共同转染Raji和Jurkat细胞。方法前期研究从1例DLBL患者外周血T细胞中发现克隆性增殖T细胞受体(TCR)Vα6和Vβ13亚家族T细胞,在此基础上利用RT-PCR扩增TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列后,分别将其定向克隆入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP,酶切和核酸序列测定分析方法鉴定重组质粒TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP的正确性;利用核转染技术(nucleofector)将其分别或共同转染Raji细胞和Jurkat细胞,24 h后利用激光共聚焦显微镜观察EGFP的瞬时表达情况,48 h后利用实时定量PCR检测TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达情况,Western blot检测EGFP蛋白的表达情况。结果获得来自DLBL患者的TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列,酶切分析和核酸序列测定证实TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染24 h后,激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光,单独转染和共转染组荧光产生情况相似;实时定量PCR在单独转染和共转染组均可检测到TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达,共转染组2基因的表达水平稍低于单独转染组;Western blot检测在单独转染和共转染组均显示EGFP蛋白的表达,2组的蛋白杂交带强度相似。结论成功构建了DLBL特异性的TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP真核表达质粒,两者可同时转染到细胞中,并实现了体外共表达。Objective To construct the eukaryotic expression plasmids TCR Vα-pIRES2-EGFP and TCR Vβ-pIRES2-EGFP specific for the diffuse large B-cell lymphoma(DLBL) associated antigen and to co-transfect the plasmids to both Raji and Jurkat cell lines.Methods Based on our previous study in which clonally expanded TCR Vα6 and TCR Vβ13 subfamily T cells were identified in a case of DLBL,the full-length TCR Vα6 and Vβ13 genes were amplified by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP to obtain TCR V...

关 键 词：DLBL TCR Vα/Vβ基因 CTL 核转染 EGFP 

分 类 号：R392.11[医药卫生—免疫学]