重建心脏生物起搏器模型的体外研究  

Recreating Cardiac Biological Pacemakers in Vitro

作　　者：童敏[1] 杨向军[1] 

机构地区：[1]苏州大学附属第一医院心内科,江苏苏州215006

出　　处：《岭南心血管病杂志》2011年第S1期198-201,共4页South China Journal of Cardiovascular Diseases

摘　　要：目的研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)改造的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与心室肌细胞共培养,构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性;并研究MSC中过表达连接蛋白45(CX45)对以上生物起搏器模型自律性的影响。方法 (1)体外分离培养新生大鼠的心室肌细胞,鉴定纯度及活力;并通过膜片钳方法记录心肌细胞的自发性动作电位。(2)基因克隆的方法构建包含HCN4基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒,转染大鼠的MSCs,构建成HCN4+MSCs;将仅转染有GFP基因的慢病毒颗粒的MSCs设为HCN4-MSCs。通过RT-PCR,以及荧光观察鉴定HCN4基因在MSCs中的表达;电压钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。(3)将HCN^4+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,同时将HCN4-MSCs与心肌细胞共培养设为"HCN4-MSCs对照组"。为了监测生物起搏器的自律性,初步分析自律性变化的原因,计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位;并通过免疫荧光标记等方法鉴定共培养的两类细胞间连接蛋白43(CX43)的表达;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸验证缝隙连接在模型中的价值。(4)为了构建CX45基因稳定表达的MSCs细胞株,首先通过基因克隆的手段构建含有CX45基因的表达质粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7,通过脂质体2000的介导将pDsRED2-N1-RFP/Gja7转染MSCs;G418筛选获得稳定转染的细胞株CX45+MSCs;同时将pDsRED2-N1-RFP空质粒转染的MSCs设为CX45-MSCs。为了鉴定MSCs中CX45基因的转录,进行了RT-PCR试验;CX43与CX45单克隆抗体免疫双标MSCs,鉴定CX45^+MSCs中连接蛋白类型的变化。(5)将CX45^+MSCs作为生物起搏的载体细胞,转染HCN4基因,构建HCN4^+CX45+MSCs;将HCN4^+CX45^+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养重新构建心脏生物起搏器;同时将CX45-MSCs中转染HCN4基因,与心肌细胞共培养后构建的生物起搏器模型设为"HCN4^+CX45目的研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)改造的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与心室肌细胞共培养,构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性;并研究MSC中过表达连接蛋白45(CX45)对以上生物起搏器模型自律性的影响。方法 (1)体外分离培养新生大鼠的心室肌细胞,鉴定纯度及活力;并通过膜片钳方法记录心肌细胞的自发性动作电位。(2)基因克隆的方法构建包含HCN4基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒,转染大鼠的MSCs,构建成HCN4+MSCs;将仅转染有GFP基因的慢病毒颗粒的MSCs设为HCN4-MSCs。通过RT-PCR,以及荧光观察鉴定HCN4基因在MSCs中的表达;电压钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。(3)将HCN^4+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,同时将HCN4-MSCs与心肌细胞共培养设为"HCN4-MSCs对照组"。为了监测生物起搏器的自律性,初步分析自律性变化的原因,计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位;并通过免疫荧光标记等方法鉴定共培养的两类细胞间连接蛋白43(CX43)的表达;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸验证缝隙连接在模型中的价值。(4)为了构建CX45基因稳定表达的MSCs细胞株,首先通过基因克隆的手段构建含有CX45基因的表达质粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7,通过脂质体2000的介导将pDsRED2-N1-RFP/Gja7转染MSCs;G418筛选获得稳定转染的细胞株CX45+MSCs;同时将pDsRED2-N1-RFP空质粒转染的MSCs设为CX45-MSCs。为了鉴定MSCs中CX45基因的转录,进行了RT-PCR试验;CX43与CX45单克隆抗体免疫双标MSCs,鉴定CX45^+MSCs中连接蛋白类型的变化。(5)将CX45^+MSCs作为生物起搏的载体细胞,转染HCN4基因,构建HCN4^+CX45+MSCs;将HCN4^+CX45^+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养重新构建心脏生物起搏器;同时将CX45-MSCs中转染HCN4基因,与心肌细胞共培养后构建的生物起搏器模型设为"HCN4^+CX45

关 键 词：生物起搏器 心肌细胞 动作电位 细胞共培养 自律性 搏动频率 缝隙连接 心室肌细胞 基因测序 模型 

分 类 号：R54[医药卫生—心血管疾病]