应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因  

作　　者：杨倩[1] 成军[1] 刘妍[1] 洪源[1] 王琳[1] 董菁[1] 张树林[2] 

机构地区：[1]中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,全军病毒性肝炎防治研究重点实验室,北京市100039 [2]西安交通大学第一医院传染科,陕西省西安市710061

出　　处：《世界华人消化杂志》2005年第1期82-85,共4页World Chinese Journal of Digestology

基　　金：国家自然科学基金攻关项目;No.C03011402;No.C30070689

摘　　要：目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2 (615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5KTP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能. 方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2 细胞为对照:提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA. 半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行茵落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因. 结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2 生物学功能提供理论依据.

关 键 词：NS5A 反式激活基因 ATP CDNA消减文库 抑制性消减杂交技术 转染 对照组 克隆 新基因 菌落PCR 

分 类 号：R346[医药卫生—基础医学]