大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化  

Cloning, Overexpression and Purification of Escherichia coli NADP-specific Glutamate Dehydrogenase in Escherichia coli

作　　者：李永海[1] 徐燕[1] 席慧[1] 刘凤华[1] 周霞[1] 高音[2] 

机构地区：[1]首都师范大学生命科学学院,北京100037 [2]首都师范大学生命科学学院蛋白质工程室,北京100037

出　　处：《首都师范大学学报（自然科学版）》2005年第1期79-83,共5页Journal of Capital Normal University：Natural Science Edition

基　　金：国家自然科学基金项目 (No .3 980 0 0 2 8);北京市科技新星计划项目 (No .9612 8)

摘　　要：谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类 ,为了进一步研究其功能 ,我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,gdhAgene) ,将所得DNA片断连接到质粒pUC18上 ,转化大肠杆菌DH5α ,进行蓝白筛选和酶切鉴定 ,经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,经SDS PAGE和双波长扫描分析 ,确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到可溶性蛋白的表达 ,表达量可达菌体总蛋白的 15 %以上 .In order to study the further function of the NADP-specific glutamate dehydrogenase(NADP-GDH),it was amplified from the E.coli DH5α by PCR,and was inserted into plasmid pUC18 for screening and DNA sequencing.The gdhA gene was subcloned into the expression vector pTrcHisC,The expression of solubility protein with SDS-PAGE electrophoresis was not found.SDS-PAGE confirmed that the molecular weight of the recombinant protein was 54 2 kDa in the orm of insoluble inclusion body and the recombinant protein accounted for above 15% of the total cell protein.

关 键 词：谷氨酸脱氢酶 大肠杆菌 高效表达 DH5Α 特异性 酶基因 双波长扫描 克隆 DNA片断 表达载体 

分 类 号：R378[医药卫生—病原生物学] Q786[医药卫生—基础医学]