银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立  

作　　者：郭丽琼[1,2] 柳永[1] 赵姝娴[1] 刘二鲜[1] 林俊芳[1,2] 

机构地区：[1]华南农业大学食品学院生物工程系,广州510640 [2]华南农业大学生物质能研究所,广州510640

出　　处：《中国科学（C辑）》2008年第10期974-981,共8页Science in China(Series C)

基　　金：国家高技术研究发展计划(批准号:2006AA10Z301);国家自然科学基金(批准号:30371000和30671457);广东省自然科学基金(批准号:032239)资助项目

摘　　要：银耳(Tremella fuciformis)属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢.银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点.本研究以gpd-Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pGlg-gfp和pGlq-hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg/mL;采用电击法把pGlq-hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为:STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1.0×108个/mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2.0kV/cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个/μgDNA.采用最佳电击参数把质粒pGlg-gfp和pGlg-hph按1︰1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37.5%.这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达.

关 键 词：银耳(Tremella fuciformis) 电击转化 银耳芽孢 完整细胞 基因表达 hph基因 GFP基因 

分 类 号：S567.34[农业科学—中草药栽培]