应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测TGF-β1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中PAI-1mRNA表达  

Detection of PAI-1 mRNA expression induced by TGF-β_1 in keloid fibroblasts using SYBR real-time fluorescence quantitative RT-PCR method

作　　者：何淑芳[1] 杨林[1] 黄维娟[1] 杨雁[1,2,3] 周伏圣[4,3] 方巧云[4,3] 张安平[4,3] 杨森[4,3] 张学军[4,3] 

机构地区：[1]安徽医科大学临床药理研究所 [2]安徽医科大学皮肤病研究所,安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科 [3]教育部"重要遗传病基因资源利用"重点实验室(省部共建),安徽合肥230032 [4]安徽医科大学皮肤病研究所安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科

出　　处：《中国药理学通报》2009年第1期64-67,共4页Chinese Pharmacological Bulletin

基　　金：中国博士后科学基金资助项目(No20060400716);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(No20070024);安徽省教育厅自然科学基金重点资助项目(NoKJ2008A30ZC);安徽医科大学校人才基金资助项目

摘　　要：目的应用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测转化生长因子-β1（transforming growth factor betal，TGF-β1）诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KFS）中纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA的表达。方法体外分离培养KFs，应用不同浓度（1．25～20pmol·L-1）TGF-β1刺激KFs3h或TGF-β1（10pmol·L-1）刺激KFs不同时间（0．5～6h），采用SYBRGreenI荧光实时定量RT—PCR法检测，以B—actin基因作为内参，计算各组PAI-1mRNA的相对表达量。结果与空白对照组相比，TGF-β1能明显诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，10、20pmol·L-1浓度组表达比值分别增至4．19及4．44倍（P〈0．01）；TGF-β1（10pmol·L。）的1、2h时问组表达比值分别增至2．29及2．41倍（P〈0．05），3、6h时间组分别增至4．19及5．83倍（P〈0．01）。提示，TGF-β1诱导KFs中PAI=1mRNA表达的最适浓度为10pmol·L-1、最适时间为3h。结论利用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测TGF-β1诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，为进一步研究瘢痕疙瘩中TGF-β1信号通路的靶基因调控机制，以及开发治疗瘢痕疙瘩的新药提供了基础。Aim To detect induced by TGF-β1 in KFs the PAI-lmRNA expression using SYBR real time fluo- rescence quantitative RT-PCR method. Methods KFs were isolated from keloid tissue and cultured in vitro. The cells were stimulated with TGF-β1 （1.25 -20 pmol · L-1） for 3 h or TGF-β1（10 pmol · L-1） for 0. 5 -6 h. Then PAI-1 mRNA expression was detected by SYBR Green I real time fluorescence quantitative RT-PCR method. S-actin gene was used as the refer- ence gene to calculate the relative expression of PAI-1 mRNA of each group. Results Compared with control group, TGF-131 （ 10,20 pmol · L - 1 ） obviously induced PAI-1 mRNA expression in KFs, Whose expression ra- tio increased to 4. 19 and 4.44 folds （ P 〈 0.01 ） respectively; the PAI-1 mRNA expression ratio was upregulated to 2.29 and 2. 41 folds with TGF-β1（10 pmol · L - 1 ） for 1,2 h （ P 〈 0. 05 ） and was up-regula- ted to 4. 19 and 5.83 folds for 3,6 h （P 〈 0. 01 ）. These results suggested that the most optimal stimula- tion conditions of TGF-β1 were： 10 pmol · L-1 ,3 h. Conclusion SYBR Green I real time fluorescence quantitative RT-PCR method can be adopted to detect PAI-1 mRNA expression induced by TGF-β1in KFs. These results provide the foundation of further investi- gating the target gene regulation mechanism of TGF-β1 signal pathway in KFs and developing new drugs to treat keloid.

关 键 词：瘢痕疙瘩 转化生长因子-β1 纤溶酶原激活物抑制剂-1 荧光实时定量RT—PCR 

分 类 号：R329.2[医药卫生—人体解剖和组织胚胎学] R342.22[医药卫生—基础医学]