TAT短肽修饰的聚乙烯亚胺-β-环糊精基因载体  

Peptide TAT modified polyethylenimine-β-cyclodextrin for gene delivery

作　　者：来利华[1] 姜启英[2] 陈丹[2] 虎义平[2] 余海[1] 王青青[1] 汤谷平[2] 

机构地区：[1]浙江大学医学院免疫学研究所,浙江杭州310058 [2]浙江大学化学生物和药物研究所,浙江杭州310028

出　　处：《浙江大学学报（医学版）》2009年第1期15-23,共9页Journal of Zhejiang University(Medical Sciences)

基　　金：国家重点基础研究(973)资助项目(2004CB518802);国家高科技研究发展计划(863计划)项目(2007AA03Z355);国家自然科学基金项目(30571068);浙江省自然科学基金重点项目(Z207572);浙江省环境工程重中之重学科开放基金(20050215)

摘　　要：目的:将HIV-1的转录反式激活蛋白(trans-activator of transcription protein,TAT)中的片段短肽(RKKRRQRRR)偶联于聚乙烯亚胺-β-环糊精(polyethylenimine-β-cyclodextrin,PEI-β-CyD)聚合物,构建出低毒性、高转染率的新型基因载体。方法:β-环糊精(β-CyD)和低分子量树枝状聚乙烯亚胺(PEI600)通过羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiim idazole,CDI)聚合形成骨架结构,通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimidy-3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]将TAT短肽偶联于PEI-β-CyD,构成新的聚合物TAT-PEI-β-CyD。采用1H-NMR和FT-IR对聚合物进行化学结构表征;凝胶电泳阻滞实验、粒径测定和透射电镜观察TAT-PEI-β-CyD对DNA的浓缩能力,以及浓缩质粒DNA后颗粒形态和粒径大小;MTT法测定载体在A293和B16细胞上的毒性,并对A293和B16细胞进行体外细胞转染实验,以PEI25kDa作为对照。结果:1H-NMR和FT-IR结果显示,TAT短肽已成功偶联到PEI-β-CyD。凝胶电泳阻滞试验显示,TAT-PEI-β-CyD在N/P为4∶1时可以完全阻滞DNA的迁移。粒径测定结果和透射电镜图像表明,TAT-PEI-β-CyD/pDNA(N/P=30∶1)复合物粒径在100nm左右。细胞毒性实验表明,在B16和A293两种不同细胞中,聚合物毒性低于PEI25kDa。体外转染结果表明,在N/P为30∶1时,聚合物在A293、B16和B16BL6细胞中的基因转染效率最高;TAT短肽的偶联能提高PEI-β-CyD在B16、B16BL6细胞上的基因转染效率。结论:实验成功构建了TAT短肽修饰的PEI-β-CyD新型基因载体。该载体毒性低,基因转染效率高。Objective： To develop a novel gene delivery vector TAT-PEI-β-CyD. Methods： β-cyclodextrin（β-CyD） was linked by low molecular weighl （PEI 600） via 1,1-carbonyldiimidazole （CDI）,and TAT peptide （RRRQRRKKRC） was coupled to PEI 600 by [N-succinimidy-3-（2 -pyridyldithio） propionate,SPDP]. The copolymer was characterized by 1H NMR and FT IR. Physiochemical characteristics of TAT-PEI-β-CyD/DNA complexes were tested by agarose gel electrophoresis and particle size measurements. Cell viability and transfection efficiency were evaluated in A293 and B16 cells using PEI 2,5 kDa as a control. Results： TAT peptide was successfully coupled to PEI β-CyD. The result of gel electrophoresis showed that the TAT-PEI-β- CyD was able to condense DNA efficiently at N/P ratio of 4. The particle size of TAT-PEI-β-CyD/DNA complexes was around 100 nm. The cytotoxicity of TAT-PEI-β-CyD was lower than that of PEI 25 kI）a. The transfection efficiency of TAT-PEI-β-CyD was higher than that of PEI 25 kDa in A293 and B16 cells at N/P ratio of 30. Conclusion： The novel vector TAT-PEI-β-CyD has been developed successfully with low cytotoxicity and high transfection efficiency.

关 键 词：聚乙烯亚胺 β-环糊精类 基因产物 TAT 遗传载体 转染 

分 类 号：R346[医药卫生—基础医学]