酶联免疫斑点法检测乙型肝炎病毒感染者抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞  

Detection of antigen-epitope-specific cytotoxic T lymphocytes in patients with hepatitis B virus infection by enzyme linked immunospot assay

作　　者：张海萍[1] 闫惠平[1] 张永宏[2] 冯霞[1] 赵艳[1] 廖慧玉[2] 刘燕敏[2] 陈煜[2] 檀玉芬[1] 刘妍[1] 

机构地区：[1]首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫研究中心,100069 [2]首都医科大学附属北京佑安医院肝病科,100069

出　　处：《中华预防医学杂志》2009年第8期690-694,共5页Chinese Journal of Preventive Medicine

基　　金：国家自然科学基金（30571723）;北京市自然科学基金（7092046）

摘　　要：目的通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性细胞毒性T细胞（CTL）抗原表位肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生γ干扰素（IFN-γ）的能力，分析不同类型HBV感染人群特异性CTL免疫应答差异。方法合成4条人类白细胞抗原（HLA）-A2限制性HBV特异性CTL抗原表位肽[分别为多聚酶P的575-583序列FLLSLGIHL（Tp），HBsAg28-39序列IPQSLDSWWTSL（Te1），HBsAg183—191序列FLLTRILTI（Te2）和HBcAg18-27序列FLPSDFFPSV（Tc）]。流式细胞术鉴定HLA基因表型。用合成的CTL表位肽分别刺激慢性乙型肝炎组（CHB）、慢性乙型重型肝炎组（CSH），既往HBV感染者（N1）组和健康献血员（N2）的PBMC，采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测分泌IFN-γ的CTL细胞的频率。结果（1）HLA—A2基因分布频率：44例CHB组为45．5％（20／44），18例CSH组为55．6％（10／18），10例N1组为60％（6／10），10例N2组全部选择以往研究已确定的HLA—A2阳性者。（2）ELISPOT检测结果：①4条HBV特异性抗原多肽反应阳性率在CHB组、CSH组、N1组和N2组分别为50％（10／20）、10％（1／10）、83．3％（5／6）和10％（1／10）。N1组反应阳性率高于CSH组（χ^2=9．000，P=0．008）和N2组（χ^2=9．000，P=0．008）。②各组对Tp、Te1、Te2和Tc四条肽的平均反应强度用斑点形成细胞（SFC）／10^6PBMC表示，采用非参数秩和检验，N1组对Tp、Te1、Te2和Tc肽的平均反应强度大于CSH组和N2组（分别为77SFC／10^6PBMCvs10SFC／10^6PBMCvs15SFC／10^6PBMC，59SFC／10^6PBMCvs0SFC／10^6PBMCvs0SFC／10^6PBMC，100SFC／10^6PBMCvs0SFC／10^6PBMCvs22SFC／10^6PBMC和57SFC／10^6PBMCvs20SFC／10^6PBMCvs30SFC／10^6PBMC，均P〈0．01）。结论各种类型HBV感染者不论病毒清除与否，都可对HBV特异性多肽产生T细胞免疫反应，这种免疫反应以既往感染者最强，慢性乙型肝炎组较弱，慢性乙型重型肝炎组缺乏，提示HBV特异性CTL应答可能是自Objective To investigate the ability of secreting interferon-γ（IFN-γ） of the peripheral blood monocular cells （PBMC） stimulated by hepatitis B virus （HBV） -specific cytotoxic T lymphocyte （CTL） epitopes peptides and to analyze the difference of CTL immune response in patients with HBV infection. Methods Four HLA-A2-restricted HBV cytotoxic T lymphocyte epitopes [ Tp： HBV polymerase 575-583 （ FLLSLGIHL）, Tel ： envelope 28-39 （ IPQSLDSWWTSL ）, Te2： envelope 183-191 （ FLLTRILTI ） and Tc： core 18-27 （FLPSDFFPSV）J were synthesized. Human leucocyte antigen （HLA）-A2 typing was detected by Flow cytometry. PBMCs which were isolated from patients with chronic hepatitis B （CHB）, patients with chronic severe hepatitis B （ CSH ）, subjects with past HBV infection （ N1 ） and healthy blood donors（N2） were stimulated by the four HLA-A2-restricted HBV CTLs epitopes. Enzyme linked immunospot （ELISPOT） assay was used to detect the frequency of secreting IFN-γ CTL in each group. Results （ 1 ）HLA-A2 typing：20 of 44 patients with CHB （45.5%） were HLA-A2 positive,10/18 （55.6%） in CSH and 6/10 （60%） in group N1 were HLA-A2 positive. 10 healthy blood donors＇ HLA-typing was detected in the early study. （2） ELISPOT results： （1）The total responses to the four epitopes in CHB, CSH, N1 and N2 groups were 50% （10/20）, 10% （1/10） ,83.3% （5/6） and 10% （1/10）, respectively. The response in N1 group was significantly higher than that in CSH group （χ^2 =9. 000,P =0. 008） and N2 group （χ^2 =9. 000, P = 0. 008 ）. （1） The CTL average magnitude response to Tp epitope, Te1 epitope, Te2 epitope and Tc epitope was also significantly higher in past HBV infection group（77 SFC/10^6 PBMC,59 SFC/10^6 PBMC, 100 SFC/ 10^6 PBMC and 57 SFC/10^6 PBMC,respectively） than that of CSH group（ 10 SFC/10^6 PBMC,0 SFC/10^6 PBMC,0 SFC/10^6 PBMC and 20 SFC/10^6 PBMC respectively, all P 〈 0. 01 ） and N2 group （ 15 SFC/10^6 PBMC,0 SFC/10^6 P

关 键 词：抗原 表面 肝炎 乙型 慢性 T淋巴细胞 细胞毒性 核酸扩增技术 

分 类 号：R446[医药卫生—诊断学] R51[医药卫生—临床医学]