耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的高表达、纯化及性质  

作　　者：张炜[1] 殷长传[1] 郑佐华[1] 蔡在龙 夏晴[1] 毛裕民[1] 

机构地区：[1]复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室

出　　处：《生物化学与生物物理学报》1998年第6期579-584,共6页

基　　金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

摘　　要：来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中的邻苯二酚２，３－双加氧酶显示出较高的热稳定性。为了获得足够量的酶以研究其理化性质并分析热稳定性的分子基础，从克隆有编码该蛋白质的ｐｈｅＢ基因的Ｅ．ｃｏｌｉ中获取它的高表达产物，经热变性处理，硫酸铵分级沉淀，ＤＥＡＥ－５２离子交换层析，ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ疏水层析，得到电泳呈单一条带的酶蛋白，得率１６％以上。该酶是由４个分子量为３６．４ｋＤ的相同亚基组成的同源四聚体。反应最适温度６０℃，最适ｐＨ８．０。摩尔消光系数经Ｔｙｒ差光谱法测定为８９（ｍｍｏｌ／Ｌ）－１·ｃｍ－１。以邻苯二酚为底物时米氏常数Ｋｍ＝１．２４×１０－５ｍｏｌ／Ｌ，转换率Ｋｃａｔ＝２４０００ｍｉｎ－１。丙酮为该酶的竞争性抑制剂，抑制常数Ｋｉ＝１６５ｍｍｏｌ／Ｌ。该酶具有较高的热稳定性：６５℃保温１ｈ不影响酶的催化活性，不可逆热变性发生在７０～８０℃之间。对化学变性剂及酸、碱的耐受力同样表明了它在结构上的稳定性。在此基础上进一步研究了不同ｐＨ条件对酶蛋白二级结构的影响。

关 键 词：圆二色性 邻苯二酚加氧酶 表达 纯化 性质 

分 类 号：Q550.3[生物学—生物化学]