人胰岛素在甲醇酵母Pichiapa storis中的分泌表达  

Secretory Expression of Human Insulin in Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

作　　者：王燕[1] 梁镇和[1] 张友尚[1] 崔大敷 冯佑民[1] 

机构地区：[1]中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室 [2]中国科学院上海生物化学研究所,上海200031

出　　处：《生物化学与生物物理学报》1999年第5期587-589,共3页

基　　金：中国科学院基础性研究重大项目

摘　　要：将猪胰岛素前体（ Ｐ Ｉ Ｐ） 基因和在其５′端引入９ 个氨基酸的间隔肽序列的 Ｐ Ｉ Ｐ 基因（ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ） 插入到 Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ 的分泌表达质粒ｐ Ｐ Ｉ Ｃ９ 中， 得到分泌表达质粒ｐ Ｐ Ｉ Ｃ９／ Ｐ Ｉ Ｐ 和ｐ Ｐ Ｉ Ｃ９／ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ 并用以转化 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｇ Ｓ１１５ 。用点杂交筛选， 获得高拷贝转化子 Ｐ３９（ｓｐ） 和 Ｓ５１（ ＋ ｓｐ） 。经１ Ｌ 摇瓶培养， Ｐ３９ 和 Ｓ５１ 在 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ 中分泌表达 Ｐ Ｉ Ｐ 和ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ 的量分别为１０ ｍｇ／ Ｌ 和４０ ｍｇ／ Ｌ。ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ 在 Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ 中的表达水平高于其在本实验室报道的 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 和 Ｋ．ｌａｃｔｉｓ 中的表达， 表明间隔肽的引入有助于提高 Ｐ Ｉ Ｐ 的表达。用１０ Ｌ 罐发酵ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ 表达量达２５０ ｍｇ／ Ｌ。 Ｐ Ｉ Ｐ 和ｓｐ Ｐ Ｉ Ｐ 经转肽得到重组人胰岛素， 其受体结合能力与猪胰岛素相同， 体内生物活力２７ Ｉ Ｕ／ｍｇ 。The porcine insulin precursor ( PIP ) gene and its derivative form sp PIP gene, which had a nona peptide (called spacer peptide, sp) added at the 5′ terminus of PIP gene, were inserted into the plasmid pPIC9 of Pichia pastoris to obtain secretory plasmid pPIC9/ PIP and pPIC9/ sp PIP , respectively. P.pastoris GS115 was transformed by pPIC9/ PIP or pPIC9/ sp PIP and the high copy strains, P39( sp) and S51(+sp), were selected by dot blotting. The expression levels of PIP and sp PIP were 10 mg/L and 40 mg/L in 1 L shake flask, respectively, indicating that the spacer peptide could increase the expression. The expression level of PIP (sp PIP) in P.pastoris was higher than that of PIP in S.cerevisiae and K.lactis reported in this laboratory. The expression level of sp PIP was 250 mg/L in 10 L fermentor. Recombinant human insulin was obtained by means of transpeptidation of PIP or sp PIP. The receptor binding capacity is identical with that of porcine insulin. In vivo biological activity of the recombinant human insulin is 27 IU/mg.

关 键 词：重组人胰岛素 分泌 甲醇酵母 表达体系 

分 类 号：Q782[生物学—分子生物学] Q578