La核糖核蛋白6对人血管内皮细胞增殖与凋亡的作用  

Regulation of proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cell by Acheron

作　　者：孙荣距[1] 汪琦瑛[2] 张建波[1] 果应菲[1] 赵晓东[1] 

机构地区：[1]解放军总医院第一附属医院急救部,北京100048 [2]解放军总医院医技部

出　　处：《中华烧伤杂志》2011年第2期156-160,共5页Chinese Journal of Burns

基　　金：国家自然科学基金（30700869）

摘　　要：目的 研究La核糖核蛋白6（Achn）在人血管内皮细胞增殖和凋亡中的调节作用.方法 （1）DMEM无血清培养基培养人血管内皮细胞株Eahy926细胞,按随机数字表法（下同）分为Achn抑制组（转染Achn抑制表达载体psi-Achn）、psi4.1空载体组（转染psi4.1）、Achn诱导组（转染Achn诱导表达载体pcDNA-Achn）、pcDNA3.1空载体组（转染pcDNA3.1）、Achn与钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）共转染组（转染pcDNA-Achn与CASK抑制表达载体psi-CASK）、空白对照组（PBS处理）,分别于转染后1、24、48、72 h用噻唑蓝法测定各组细胞570 nm波长下的吸光度值.（2）取Eahy926细胞,裂解细胞总蛋白,二辛丁酸法定量后分为蛋白质印迹组（总蛋白量为20μg）、Achn蛋白沉淀组、CASK蛋白沉淀组、IgG对照组,后3组细胞蛋白总量各为100μg,免疫共沉淀法检测各组Achn、CASK蛋白水平.（3）取Eahy926细胞分为LPS组（5 mol/L LPS处理）、氯化钾组（5 mol/L氯化钾处理）、空白对照组（5 mol/L PBS处理）、Achn诱导转染组（转染pcDNA-Achn）、Achn与CASK共转染组（转染pcDNA-Achn与psi-CASK）,转染组转染24 h后加入LPS刺激12 h,免疫组织化学法检测各组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白表达.（4）取Eahy926细胞分为Achn诱导组（转染pcDNA-Achn）、Achn抑制组（转染psi-Achn）、对照组（PBS处理）,24 h后加入烧伤患者血清处理12 h,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.对实验数据行t检验和单因素方差分析.结果 （1）Achn抑制组细胞增殖水平从24 h开始低于psi4.1空载体组,48、72 h时差异均有统计学意义（t值分别为10.777、6.112,P值均小于0.05）;转染后24、48、72 h Achn诱导组细胞增殖水平均显著高于pcDNA3.1空载体组（t值分别为5.367、6.053、9.831,P值均小于0.05）;Achn与CASK共转染组细胞增殖水平48、72 h均显著低于Achn诱导组（t值分别为5.481、9.517,P值均小于0.05Objective To investigate regulatory effect of Acheron （Achn） on proliferation and apoptosis of human vascular endothelial cell. Methods （ 1 ） Eahy926 cells were cultured in serum-free DMEM medium （96-well plates） and were divided into Achn inhibition group （transfected with plasmid psi-Achn）, psi4.1 group （transfected with psi4. 1 empty vector）, Achn induction group （transfected with pcDNA-Achn）, pcDNA3.1 group （transfected with pcDNA3.1 empty vector）, cotransfection group [cotransfected with pcDNA-Achn ＋ psi-calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase （CASK）] , blank control group （treated with PBS） according to the random number table （the same method below）. The cell proliferation was determined by MTT assay at post transfection hour （PTH） 1, 24, 48, 72, with expression of absorbance value. （2） Total protein of Eahy926 cells were extracted and quantitated by BCA assay, and then they were divided into Achn antibody precipitation group （100 μg protein） , CASK antibody precipitation group （ 100 μg protein）, IgG antibody group （ 100 μg protein）, Western blot group （20 μg protein）.Achn and CASK protein levels were determined by immunoprecipitation and Western blot. （3） Synchronously cultured Eahy926 cells were divided into LPS induction group （treated with 5 mol/L LPS）, Achn transfection group （transfected with pcDNA-Achn）, cotransfection group （cotransfected with psi-CASK and pcDNA-Achn） , KCl group （treated with 5 mol/L KCl）, and blank control group （treated with 5 mol/LPBS）. Cells in transfection groups were stimulated by LPS for 12 hours after PTH 24. Caspase-3 protein level was detected by immunohistochemistry. （4） Synchronously cultured Eahy926 cells were divided into Achn inhibition group （transfected with psi-Achn vector）, Achn induction group （ transfected with pcDNA-Achn vector）, and blank control group （ treated with PBS）. Apoptosis rate was determined by FITC/PI with flow cytometry. Data

关 键 词：烧伤 内皮细胞 细胞增殖 细胞凋亡 La核糖核蛋白6 钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶 

分 类 号：R644[医药卫生—外科学]