重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶动力学分析  

Kinetics of thioredoxin glutathione reductase of Schistosoma japonicum

作　　者：宋丽君[1] 李家璜[2] 余传信[1] 华子春[2] 殷旭仁[1] 钱春艳[1] 王瑜[1] 张伟[1] 柯雪丹[1] 

机构地区：[1]江苏省血吸虫病防治研究所,卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室,江苏无锡214064 [2]南京大学生物医药国家重点实验室,江苏南京210000

出　　处：《中国病原生物学杂志》2011年第8期594-599,共6页Journal of Pathogen Biology

基　　金：国家传染病重大专项(No.2008ZX10004-011);国家自然科学基金项目(No.30972581);江苏省自然科学基金项目(No.BK2008110);江苏省科技厅公益专项基金项目(No.BM2007704);江苏省医学重点人才基金项目(No.RC2007095)

摘　　要：目的对重组的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)进行酶动力学特征分析。方法用阿糖胞苷-2’,5’-二磷酸琼脂糖凝胶通过亲和层析纯化重组SjTGR蛋白。利用紫外分光光度计(UV-2550,SHIMADZU),在25℃条件下分别以5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、胰岛素、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、β-羟乙基二硫化物(HED)为底物,测定SjTGR的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白(Grx)活性及其米氏常数。以金诺芬为抑制剂,测定其对SjTGR活性的抑制作用及抑制常数。结果 SjTGR是一种具有TrxR,GR,Grx活性的多功能酶,酶活性分别为8.11、2.19和12.10μmol·min-1mg-1。不同的酶底物得到的Km值分别为(21.42±0.44)μmol·L-1(NADPH)、(3.24±0.40)μmol·L-1(Trx)(、145.05±6.31)μmol·L-1(DTNB)(、49.55±6.31)μmol·L-1(GSSG)、(2 792±231)μmol·L-1(HED)(、1 698±54)μmol·L-1(GSH)。金诺芬对SjTGR活性有明显的抑制作用,5 nmol·L-1重组SjTGR的TrxR、GR、Grx半数抑制浓度(IC50)值分别为6.89、0.47和8.12 nmol·L-1,TrxR、GR的抑制常数(Ki)分别为为0.762和0.034 nmol·L-1。金诺芬对SjTGR的TrxR活性抑制作用为竞争抑制,而对SjTGR的GR活性的抑制作用为非竞争抑制作用。结论 SjTGR具有TrxR、GR、Grx三种酶活性,能被金诺芬所抑制,是开发抗日本血吸虫新药的分子靶标。Objective To analyze the kinetics of recombinant thioredoxin glutathione reductase of Schistosoma japonicum（SjTGR）.Methods Purified SjTGR was prepared by affinity chromatography with an adenosine 2＇,5＇-diphosphate agarose（sigma A3515） column.Thioredoxin reductase（TrxR） activity,glutathione reductase（GR） activity,and glutaredoxin（Grx） activity of recombinant TGR with the substrates 5,59-dithiobis（2-nitrobenzoic acid）（DTNB）,insulin,glutathione disulfide（GSSG）,and β-hydroxyethyl disulfide（HED） were analyzed at 25 ℃,monitored with a UV-visible spectrophotometer（UV-2550,SHIMADZU）,and the Km value of each substrate was also calculated.Auranofin served as an inhibitor,and the inhibition and inhibitory constants（Ki） of auranofin with recombinant SjTGR were determined.Results An enzymatic assay showed that SjTGR was a multifunctional enzyme with TrxR,GR,and Grx activity,and the enzyme activity of TrxR,GR,and Grx was 8.11,2.19,and 12.10 μmol·min-1mg-1,respectively.The Km of TGR on different substrates was（21.42±0.44） μmol·L-1（NADPH）,（3.24±0.40） μmol·L-1（Trx）,（145.05±6.31） μmol·L-1（DTNB）,（49.55±6.31） μmol·L-1（GSSG）,（2 792±231） μmol·L-1（HED）,and（3 831±54） μmol·L-1（GSH）.Auranofin markedly inhibited the activity of SjTGR.The half inhibitory concentration（IC50） of auranofin with respect to 5 nmol·L-1 recombinant SjTGR was 6.89 nmol·L-1 for a DTNB substrate,0.47 nmol·L-1 for a GSSG substrate,and 8.2 nmol·L-1 for an HED substrate.The Ki value for TrxR activity was 0.762 nmol·L-1 and that for GR activity was 0.034 nmol·L-1.Auranofin competitively inhibited TrxR activity while it non-competitively inhibited GR activity.Conclusion SjTGR had high levels of TrxR,GR,and Grx activity that were effectively inhibited by auranofin.SjTGR is a target for development of novel chemotherapeutic agents against schistosomiasis japonica.

关 键 词：血吸虫 日本 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 酶动力学 金诺芬 抑制剂 

分 类 号：R383.24[医药卫生—医学寄生虫学]