美国黑核桃SSR反应体系优化  

Optimization of SSR Reaction System in Juglans nigra

作　　者：赵鹏[1,2,3] Keith E.Wosete 程飞[1] 张硕新[1,4] 

机构地区：[1]西北农林科技大学林学院,杨凌712100 [2]西北大学生命科学学院西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验,陕西710069 [3]美国普渡大学森林与自然资源系,农业部阔叶树种改良与更新中心,印第安纳西拉法叶47907 [4]陕西秦岭森林生态系统国家野外科学观测研究站,宁陕711600

出　　处：《植物研究》2012年第2期213-221,共9页Bulletin of Botanical Research

基　　金：美国印第安纳州自然保护局核桃遗传与保护研究项目(#2041-0006);西北大学科研启动基金(PR11055)

摘　　要：优化SSR-PCR反应体系是黑核桃(Juglans nigra L.)SSR基因鉴定和群体遗传等研究的基础。本研究通过对PCR反应中Mg2+浓度、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA量的组合以及PCR程序组合试验,确定了黑核桃SSR的最佳反应体系,即在10μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg.mL-1牛血清蛋白(BSA),0.25 mmol.L-1 dNTPs,1.5 mmol.L-1 Mg2+1μL 10XTaq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,1.0 mmol.L-1单对引物(0.5 mmol.L-13对引物)。SSR-PCR反应扩增程序为:94℃变性3 min;93℃变性15 s,50℃或者53.5℃退火1 min,72℃延伸30 s,32个循环;72℃后延伸10min,置4℃保存。利用此反应体系对黑核桃进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,适合进一步对黑核桃群体遗传、基因型鉴定和分子生态研究。The optimization of the SSR-PCR （ simple tern is an important basic protocol when SSRs are used its research in black walnut （Juglans nigra L. ）. We sequence repeat-polymerase chain reaction） reaction sys- for pedigree construction, genotyping or population genet- systematically tested the concentrations of Taq DNA poly- merase, BSA, dNTPs, Mg2＋ , primers, and template DNA concentration in the PCR reaction to determine the optimal reaction system. The results indicated that the optimal SSR-PCR reaction conditions for black walnut （J. nigra L. ） included a total volume of 10 μL containing 1 ixL of 10 ng· ixL-1 DNA, 1 I.LL of 10 X Taq DNA polymerase reaction buffer （ 1.5 mmol · L- 1 Mg2 ＋）, 1.25 IxL of 200 mmol · L- 1 Mg2 ＋dNTPs （0.3 mmol · L- 1 Mg2 ＋）, 1 IxL of 1 mg · mL-1 BSA （Bovine Serum Albumin, 0.1 mg · mL-l）, 1.0μL of 10 μmol· L- 1 each primer （when using one pair primer in each PCR reaction） or 0.5μL of 10 ·mol · L- 1 each primer （when using three pairs primer in each PCR reaction）, 0.5 units Taq polymerase, and 4.5 μL sterilized distilled water. The ther- mal cycling conditions were as follows： denaturation 3 min at 94℃ ; 32 cycles of 15 s at 93℃ 1 min at the an- nealing temperature for the primer, 30 s at 72℃ ; and a final extension of 10 min at 72℃ at the end of the ampli- fication. The results showed that this SSR-PCR protocol resulted in clear, reproducible results suitable for the a- nalysis of population genetics, genotyping, and for molecular ecology.

关 键 词：黑核桃 微卫星 反应体系 群体遗传 

分 类 号：S664.1[农业科学—果树学]