美国和日本核桃RAPD-PCR反应体系优化  

Optimization of RAPD-PCR reaction system for American and Japanese walnut

作　　者：赵鹏[1,2,3] Keith E.Woeste 张存旭[1] 程飞[1] 张硕新[1,4] 蔡靖[1,4] 

机构地区：[1]西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100 [2]美国普渡大学森林与自然资源系,美国农业部阔叶树种改良与更新中心,美国西拉法叶市印第安纳州47907 [3]西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西西安710069 [4]陕西秦岭森林生态系统国家野外科学观测研究站,陕西宁陕711600

出　　处：《中南林业科技大学学报》2012年第3期129-135,共7页Journal of Central South University of Forestry & Technology

基　　金：国家"十二五"科技支撑计划课题"高效可持续农林复合系统构建及调控技术研究"(2011BAD38B0202);西北大学科研启动基金(PR11055);美国印第安纳州自然保护局核桃遗传与保护研究项目(#2041-0006)

摘　　要：核桃属种质资源丰富,其中多数物种木材材质优良,果实可食,营养丰富,为重要的经济树种。以美国白核桃Juglans cinerea、日本核桃Juglans ailantifolia等为材料,通过改良CTAB方法,从嫩芽、新鲜叶片和干叶片中分别提取核桃基因组DNA,并以此DNA为模板对RAPD-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果表明,改良的CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染,大大提高DNA的数量和质量。优化适合于美国核桃、日本核桃和杂合核桃的RAPD-PCR反应体系为:在20μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg/mL牛血清蛋白(BSA),0.25 mmol/L dNTPs,3.5 mmol/L Mg2+,1μL10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,5.0 mmol/L RAPD引物。RAPD-PCR反应扩增程序为:92℃变性3 min;93℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃后延伸10 min,置4℃保存。Germplasm resources for the genus Juglans（Juglandaceae） are rich,and the genus contains many tree species,commonly called walnuts,that are valued for their high quality timber and nuts.The CTAB method was improved to extract genomic DNA from walnut buds,fresh and dried leaves.Using the obtained DNA as templates,the important parameters influencing the application of RAPD-PCR for walnut species were optimized.The results indicate that the modified CTAB method more effectively removed most of the polysaccharides in the cytoplasm and inhibited the formation of oxidized polyphenolic compounds,compared with the traditional CTAB method.The optimal RAPD-PCR reaction conditions for Juglans cinerea,Juglans ailantifolia,J.nigra,and species hybrids included,in a total volume 20 μL,1μL of 10 ng/μL DNA,2 μL of 10×Taq DNA polymerase reaction buffer（1.5 mmol/L Mg2＋）,2.5 μL of 200 mmol/L dNTPs（0.25 mmol/L）,2 μL of 1mg/mL BSA（bovine serum albumin,0.1 mg/mL）,2 μL of 25 mmol MgCl2（2.5 mmol）,4 μL of 50 mmol RAPD decamer primer pair,0.5 units Taq polymerase,and 5.0 μL sterilized distilled water.Thermal cycling conditions were as follows： denaturation 3 min at 92℃;35 cycles of 1 min at 92℃,1 min at 35℃,2 min at 72℃;and a final extension of 10 min at 72℃ at the end of the amplification.

关 键 词：美国白核桃 日本核桃 RAPD 优化 

分 类 号：S792.13[农业科学—林木遗传育种]