大鼠Fas shRNA真核表达质粒的构建及其生物活性的鉴定  

作　　者：李海龙[1] 温儒民[1] 薛松[1] 肖永双[1] 孙晓青[1] 

机构地区：[1]徐州医学院附属医院泌尿外科,江苏徐州221002

出　　处：《徐州医学院学报》2012年第9期601-607,共7页Acta Academiae Medicinae Xuzhou

摘　　要：目的构建大鼠FasshRNA真核表达重组质粒，并检测其对NRK-52E细胞（大鼠肾小管上皮细胞）Fas基因的沉默效率，筛选出一个最有效干扰质粒。方法按照siRNA设计原则，在大鼠Fas基因mRNA上挑选4个干扰靶序列，再根据靶序列分别设计并合成两端含有酶切位点的总长度为64bp的shRNA转录模板DNA正、反义寡核苷酸链，并将其退火后克隆至空载体pSliencerTM3．1～H1 neo siRNA Expression Vector中，对其进行鉴定。用Lipofectamine LTX Reagent将pSilencer Fas（1～4）4个重组质粒转染至大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内，以pSilencer—EGFP shRNA和pEGFP—N1质粒共转染做阳性对照，经过G418压力性筛选后，使用RT—PCR和蛋白免疫印迹法分析针对Fas基因构建的4个重组质粒的有效性，筛选出最有效的干扰质粒。结果pSilencer-Fas（1～4）shRNA及pSilencer—EGFPshRNA重组质粒测序结果与预期序列相同。RT—PCR及蛋白免疫印迹结果显示pSilencer—Fas4shRNA对Fas基因在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均最高，分别达到（78．9±3．2）％和（64．5±4．62）％。结论利用RNA干扰技术沉默大鼠Fas基因，可以降低大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）Fas的表达。

关 键 词：Fas蛋白(CD95) RNA干扰 SHRNA 移植免疫耐受 

分 类 号：R322.61[医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]