7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因突变库与高通量筛选体系的构建  

作　　者：李慧仙[1] 朱平[1] 

机构地区：[1]天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室中国医学科学院,北京协和医学院药物研究所,北京100050

出　　处：《菌物研究》2013年第2期143-143,共1页Journal of Fungal Research

基　　金：国家自然科学基金项目(31270796);"重大新药创制"科技重大专项(2012ZX09301002-001-005);中央高校基本科研业务费专项(2012N06)

摘　　要：对7－木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl－p1－2基因进行定向进化的初步研究，确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型。利用易错PCR技术对Lxyl－pl－2基因进行随机突变，比较不同浓度M聋’进行易错PCR，每组随机挑取10个克隆进行测序。序列分析表明：在M聋’浓度为7mmol／L条件下，碱基平均突变率为0．12％，即对于Lxyl－p1－2基因（2．4kb）来说，每个基因序列平均有3个碱基突变，达到构建突变文库的频率要求，选择该条件作为易错PCR条件。利用in-fusion技术将Lxyl－p1－2突变基因克隆到pPIC3．5K载体中，获得大量重组突变质粒。该研究优化了in-fusion连接反应中基因片段和载体片段的摩尔比，并探讨了基因片段与载体片段问同源序列长度对in—fusion连接效率的影响。试验结果表明：基因片段与载体片段的摩尔比最佳梯度为5：1；同源序列长度的选择成为影响in—fusion连接效率的关键因素之一。当同源序列长度为100bp时连接效率达到最大值，且显著高于同源序列长度为15～50bp的连接效率，此时阳性重组率提高至90％左右。与常规酶切一连接法相比，in-fusion法具有明显优势，同时将克隆周期由3～4d缩短为1～2d。挑取单菌落，在48微孔培养板上进行培养、诱导表达2d后，取菌液进行酶活测定（底物PNP-Xyl）。以野生型为例，β-木糖苷酶的酶活013405均数μ=3．415，其数据组标准差为δ=±0．078，数值符合正态分布的原理，建立统计学野生型均数分布范围和48微孔板高通量筛选，为后续突变体筛选提供基础。

关 键 词：糖基水解酶 易错PCR In-fusion技术 48微孔板高通量筛选 

分 类 号：Q556[生物学—生物化学] Q785