关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备  

作　　者：穆杨[1] 刘园园[1] 李亮亮[1] 刘阳[1] 尚川川[1] 周恩民[1] 

机构地区：[1]西北农林科技大学动物医学院,西北农林科技大学兽医免疫生物学研究所,陕西杨凌712100

出　　处：《细胞与分子免疫学杂志》2013年第9期953-957,共5页Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology

基　　金：国家自然科学基金(31201883,U0931003/L01);陕西省科技攻关项目(2008K02-05)

摘　　要：目的克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体。方法提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白。用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价。结果成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75%,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M_r)约15 000,而BL21表达的目的蛋白M_r约30000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1:12 800。结论克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体。

关 键 词：猪 IL-5 表达 多克隆抗体 ELISA 

分 类 号：R392.11[医药卫生—免疫学] S828[医药卫生—基础医学]