双重氧化酶1引起变应性疾病发生机制的初步研究  

Primary mechanism of the role of dual oxidase-1 causing airway allergic diseases in human bronchial epithelium

作　　者：王丽芬[1] 黄志纯[1] 吴修法[1] 王海飞[1] 

机构地区：[1]东南大学附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科,南京210009

出　　处：《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》2013年第10期823-829,共7页Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery

摘　　要：目的 探讨双重氧化酶-1 （dual oxidase-1,DUOX-1）在人气道上皮细胞（human bronchial epithelial cell）中导致气道高反应性的机制.方法 选择正常培养的人气道上皮细胞分为健康对照组、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激组、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin,M-β-CD）＋ TNF-α处理组、地昔帕明（desipramine,DES）＋TNF-α处理组、二亚苯基碘（diphenylene iodonium,DPI）＋TNF-α组、夹竹桃麻素（apocynin,APO）＋TNF-α组.利用TNF-α作为刺激因素,采用蔗糖梯度离心的方法提取脂筏并应用免疫蛋白印记方法分析各组细胞膜上DUOX-1的含量；利用激光共聚焦显微镜观察细胞膜上DUOX-1的表达,同时观察其与脂筏标记蛋白霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit,CTXB）和神经酰胺（ceramide）的共定位现象；用活性氧试剂盒检测细胞内活性氧的生成.采用Sigmastat 3.02软件进行统计学处理.结果 ①活性氧的生成,对照组：l.00±0.00;TNF-α组：1.95±0.16;M-β-CD＋TNF-α组：0.91±0.16; DES＋ TNF-0组：1.49 ±0.20;DPI＋TNF-α组：1.03±0.16；APO＋ TNF-α组：1.47±0.26；六组差异有统计学意义（F=3.83,P＜0.05）.②DUOX-1蛋白的含量,对照组：0.21 ±0.02;TNF-α组：0.49±0.04;M-β-CD＋TNF-α组：0.08±0.02；DES＋TNF-α组：0.09±0.03；差异有统计学意义（F=3.96,P＜0.05）.③DUOX-1蛋白荧光值,对照组：1.72±0.21；TNF-α组：8.11±1.23；M-β-CD＋ TNF-α组：1.51±0.32,DES＋TNF-α组：1.43±0.11；差异有统计学意义（F =4.87,P＜0.05）.④DUOX-1蛋白基因检测,对照组：1.00±0.00；小胞浆RNA（small cytosol RNA,ScrRNA）＋TNF-α组：1.75±0.04;DUOX-1ScrRNA＋TNF-α组：1.15±0.02;差异有统计学意义（F=4.19,P＜0.05）.结论 TNF-α可以引起气道上皮细胞内DUOX-1在脂筏中的含量增加,并导致该酶的激活,从而致气道上皮细胞活性氧产生增加,引起气道高反应性,可能导致变应性疾病的发生；酸�Objective To investigate the role of dual oxidase-1 （DUOX-1） inducing airway hyperresponsiveness in human bronchial epithelium.Methods The human bronchial epithelial cells were divided into several groups：control group,tumor necrosis factor-α （TNF-α） group,methyl-β-cyclodextrin （M-β-CD） ＋ TNF-α group,desipramine （DES） ＋ TNF-α group,diphenylene iodonium （DPI） ＋ TNF-α group and apocynin （APO） ＋ TNF-α group.Fractionation was performed by sucrose gradient centrifugation and the protein DUOX-1 was measured by western blotting.The lipid raft clusters and its colocalization with DUOX-1 were confocal analysed.The intracellular reactive oxygen species （ROS） accumulation was measured by fluorescence of reactive oxygen probe of intracellular measurement.Sigmastat 3.02 software was used to analyze the data.Results （1） Detection of ROS,control group：1.00± 0.00 ; TNF-α group：1.95± 0.16 ; M-β-CD ＋ TNF-α group：0.91 ± 0.16 ; DES ＋ TNF-α group：1.49± 0.20 ; DPI ＋ TNF-α group：1.03 ± 0.16 ; APO ＋ TNF-α group：1.47 ± 0.26.The difference was statistically significant （F =3.83,P 〈0.05）.（2） Extracts in rafts to lipid rafts region represents the ratio of total protein,protein content DUOX-1each group,control group：0.21 ± 0.02; TNF-α group：0.49 ± 0.04; M-β-CD ＋ TNF-α group：0.08 ±0.02 ; DES ＋ TNF-α group：0.09 ± 0.03 ; the difference was statistically significant （F =3.96,P 〈 0.05）.（3） DUOX-1 protein fluorescence values,control group：1.72 ± 0.21; TNF-α group：8.11 ± 1.23; M-β-CD ＋ TNF-α group：1.51 ± 0.32; DES ＋ TNF-α group：1.43 ± 0.11 ; the difference was statistically significant （F =4.87,P 〈 0.05）.（4） DUOX-1 gene detection,control group：1.00 ± 0.00 ScrRNA ＋TNF-α group：1.75 ± 0.04; DUOX-1siRNA ＋ TNF-αgroup：1.15 ± 0.02; the difference was statistically significant （F =4.19,P 〈 0.05）.Conclusion TNF-α can induce DUOX-1 expression increasing in lipid raft,then the DUOX-1 can

关 键 词：NADP氧化酶 呼吸超敏反应 膜微区 上皮细胞 肿瘤坏死因子Α 地昔帕明 神经酰胺类 

分 类 号：R593.1[医药卫生—内科学]