羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制  

Effect of hydroxycamptothecin combined with etoposide on apoptosis of human Tenon capsule fibroblast and its mechanism

作　　者：于东毅[1] 傅煜轩[2] 姚志峰[1] 袁志兰[3] 

机构地区：[1]南京医科大学第一临床医学院,210029 [2]南京医科大学生理学实验室,210029 [3]南京医科大学第一附属医院眼科,210029

出　　处：《中华实验眼科杂志》2014年第2期125-130,共6页Chinese Journal Of Experimental Ophthalmology

基　　金：国家自然科学基金资助项目（81271001）

摘　　要：背景研究表明，羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡，但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性，并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库，采用组织块培养法培养和传代HTFs，采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板，分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1，终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h，用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组，药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白，采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形，波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后，随着药物质量浓度的增加，对HTFs增生的抑制率增加，差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34，P=0．00；VP-16：F=62．60，P=0．00；HCPT＋VP-16：F=46．77，P=0．00），HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L，HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399，表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％，�Background Previous study showed that both hydroxycamptothecin （HCPT） and etoposide （VP-16） can induce the apoptosis of human Tenon capsule fibroblasts （HTFs）. However, whether the combination of HCPT with VP-16 enhance the efficacy of drugs is unknown. Objective This study was to investigate the synergistic effect and its mechanism of HCPT combined with VP-16 on apoptosis of HTFs. Methods Human Tenon capsule tissue was obtained from the eye bank of Jiangsu Province People＇s Hospital. HTFs were cultured in vitro using explant method and identified by immunofluorescence with vimentin. The fourth generation of cells were incubated in 96-well plate, and different concentrations of HCPT （ 1,5,10,50,100 mg/L） , VP-16 （ 0. 6,2.5,5.0, 25.0,50.0 mg/L） and HCPT＋VP-16 （2 ： 1 ,final concentrations O. 80,3.75,7.50,37.50,75.00 mg/L） were added for 24 hours. The inhibiting rate of drugs to HTFs growth was detected using CCK-8 kit. The HTFs were divided into blank control group, HCPT （50 mg/L） treated group, VP-16 （25 mg/L） treated group and HCPT ＋ VP-16 （37.5 mg/L） treated group, and the apoptosis rates of HTFs in various groups were assayed by flow cytometry. The expressions of caspase-3, cleaved caspase-3, bax, bcl-2, JNK, p-JNK, Akt, p-Akt in the cells were detected by Western blot assay. Results Cultured cells grew well with the polygon shape and positive response for vimentin. The inhibiting rate was elevated with the increase of drug dosage 24 hours after addition of drugs （HCPT： F=41.34,P= 0.00 ;VP-16 ： F = 62.60, P = O. 00 ; HCPT ＋ VP-16 ： F = 46.77, P = O. 00 ）. The half maximal inhibitory concentrations （ ICs0 ） of HCPT, VP-16, HCPT＋VP-16 were 80.99,27.93,19.81 mg/L, respectively, and the combined index （CI） of HCPT with VP-16 was 0. 399, showing a stronger synergistic action. The apoptotic rates of HTFs were （4.87± 0.78） %,（11.20±1.94）%,（12.67±1.51）% and （19.77±2.01）% in the blank control group,HCPT treated group,VP-16 treated grou

关 键 词：羟基喜树碱 依托泊苷 人Tenon囊成纤维细胞 凋亡 协同作用 细胞培养 体外 

分 类 号：R96[医药卫生—药理学]