CYP3A4沉默细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响  

作　　者：徐新云[1] 毛侃琅[1,2] 袁建辉[1] 毛吉炎[1,2] 吴德生[1] 黄海燕[1] 谢杏[1,2] 秦逍云[1,2] 谭琴[1,2] 

机构地区：[1]深圳市疾病预防控制中心卫生毒理学重点实验室/深圳市现代毒理学重点实验室,广东深圳518055 [2]深圳大学生命科学学院

出　　处：《毒理学杂志》2014年第1期58-63,共6页Journal of Toxicology

基　　金：深圳市科技计划重点项目(201101015)

摘　　要：目的构建CYP3A4基因沉默载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4沉默细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到pLKO.1-puro中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4沉默细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP3A4沉默细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)表达变化。结果测序证明插入pLKO.1-puro载体的干扰序列与设计的序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常L02肝细胞下降77.3%,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常L02肝细胞下降84.6%。CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02细胞的表达水平;Caspase-3表达水平无明显改变;Caspase-8仅在TCE高剂量组表达下降;Caspase-9在TCE剂量≥1.0 mmol/L表达水平下降;癌基因c-fos、c-myc、k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4沉默细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。

关 键 词：肝细胞 CYP3A4 慢病毒载体 CYP3A4基因沉默细胞 三氯乙烯 

分 类 号：R114[医药卫生—卫生毒理学]