低浓度胰蛋白酶消化法优化大鼠角质形成细胞的传代培养  

作　　者：尚玉茹[1] 申传安[1] 柴家科[1] 马丽[1] 李大伟[1] 李龙珠[1] 尹凯[1] 

机构地区：[1]解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所,北京100048

出　　处：《中华烧伤杂志》2014年第2期179-181,共3页Chinese Journal of Burns

基　　金：国家自然科学基金面上项目（30971128、81373140）;全军医学科技“十二五”科研项目面上项目（CWSllJ097）;首都临床特色应用研究（Z12110700102092）

摘　　要：目的了解通过改良传代技术是否可获取高增殖活性的大鼠KC，为体外研究提供种子细胞。方法将从3只清洁级新生SD大鼠背部皮肤中分离、培养的原代KC按随机数字表法分为改良组和传统组，改良组采用0．25g／L胰蛋白酶联合0．4g／L乙二胺四乙酸消化传代，传统组采用2．5g／L胰蛋白酶结合0．4g／L乙二胺四乙酸消化传代。收集2组原代细胞及传代细胞于倒置相差显微镜下进行形态学观察。取部分第1代细胞，应用锥虫蓝染色法观察细胞存活情况并计算存活率（样本数为3）；另取第1代细胞培养1、12、24h，噻唑蓝比色法进行细胞黏附实验（以吸光度值表示黏附细胞数量，每时相点样本数为6）。取第5代细胞，采用流式细胞仪检测细胞周期，B半乳糖苷酶染色法计算衰老细胞百分比。对数据行LSD-t检验。结果改良组原代细胞、第5代细胞及第18代细胞形态类似，呈圆形或小的多角形，或呈鹅卵石样；传统组原代细胞形态与改良组类似，第5代细胞胞体变大，增殖缓慢，呈片状覆盖，无法再继续传代。改良组细胞存活率为（94．6±1．7）％，显著高于传统组[（66．2±2．6）％，t=15．815，P〈0．05]。培养1、12、24h，改良组黏附细胞数量分别为0．205±0．015、0．225±0．014、0．265±0．021，均显著多于传统组（0．176±0．015、0．196±0．011、0．221±0．019，t值分别为2．947、3．517、3．476，P值均小于0．05）。改良组（S＋G2／M）期细胞所占比例[（30．6±2．3）％]显著高于传统组[（17．0±5．6）％，t=3．890，P〈0．05]。改良组衰老细胞百分比[（10．9±2．0）％]显著低于传统组[（75．9±4．1）％，t=24．624，P〈0．05]。结论低浓度胰蛋白酶消化法能减轻细胞损伤、提高细胞活性、增加传代次数，为实验研究创造良好条件。

关 键 词：胰蛋白酶 连续传代 大鼠 角质形成细胞 

分 类 号：R329.2[医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]