产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423-Ile位点的突变导致固氮酶催化活性降低  

作　　者：郭青娟 彭涛[1] 常天驹 张刚[1] 姜伟[1] 李颖[1] 李季伦[1] 

机构地区：[1]农业生物技术国家重点实验室中国农业大学生物学院,北京100193

出　　处：《科学通报》2014年第13期1215-1222,共8页Chinese Science Bulletin

基　　金：国家重点基础研究发展计划(2010CB126504);农业生物技术国家重点实验室项目;中国农业大学研究生科研创新专项(KYCX2011023)资助

摘　　要：基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.

关 键 词：产酸克雷伯氏杆菌 固氮酶 催化机制 定点突变 质子 电子传递途径 

分 类 号：Q936[生物学—微生物学]