噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计  

作　　者：梁铁兵[1] 谭克辉[1] 种康[1] 朱至清[1] S.Pongor A.Simoncsits 

机构地区：[1]中国科学院植物研究所,北京100093 [2]International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

出　　处：《中国科学（C辑）》2001年第3期220-229,共10页Science in China(Series C)

基　　金：CGEB fellowship资助项目;中国科学院知识创新工程青年科学家小组资助项目;中国科学院知识创新工程重大资助项目

摘　　要：单链阻遏蛋白ＲＲＴＲＥＳ是噬菌体４３４阻遏蛋白的衍生物，含有两个ＤＢＤ（ＤＮＡ结合结构域），一个是野生型噬菌体４３４的ＤＢＤ－Ｒ，另一个是突变型ＤＢＤ－ＲＴＲＥＳ，二者用重组接头以头接尾的方式连接起来．ＲＴＲＥＳ的ａ－３－螺旋中－１，１，２，５位ＤＮＡ结合氨基酸分别为Ｔ，Ｒ，Ｅ，Ｓ．利用核心序列是ＣＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＮＮＮＮＮＮＴＴＴＡＴＧ的随机ＤＮＡ库，体外循环筛选ＲＴＲＥＳ的ＤＮＡ结合位点，将筛选到的群体克隆、测序．单链阻遏蛋白ＲＲＴＲＥＳ的亲和力测定表明，最适操纵区序列含有ＴＴＡＣ或ＴＴＣＣ（上述画线部分）时，　Ｋｄ值在　１０－１２～－１１　ｍｏｌ／Ｌ的范围．天然噬菌体４３４阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的　　Ｋｄ值在１０－９ｍｏｌ／Ｌ数量级，与之相比，所筛选操纵区的亲和力明显提高．同时发现，亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响，特别是５’位碱基的影响．根据ＲＴＲＥＳ的识别特性，设计了共有序列为ＧＴＡＡＧＡＡＡＲＮＴＴＡＣＮ或ＧＧＡＡＧＡＡＡＲＮＴＴＣＣＮ（Ｒ为Ａ或Ｇ）的单链阻遏蛋白ＲＴＲＥＳＲＴＲＥ的操纵区序列．结果表明，它们之间有特异性结合，且亲和力也很高．此方法可望用于其他ＤＮＡ结合蛋白新?

关 键 词：结合位点筛选 424噬菌体阻遏蛋白 单链阻遏蛋白 DNA-蛋白质相互作用 蛋白质工程 

分 类 号：Q51[生物学—生物化学]