高粱胞质雄性不育及保持系的RAPD技术优化  

A study on the optimum for RAPD experimental protocol of CMS sorghum and their maintainers

作　　者：范昌发[1] 孙春昀[2] 孙毅 王景雪 贾敬芬[1] 何军贤[2] 郭骁才[4] 

机构地区：[1]西北大学生命科学学院,陕西西安710069 [2]四川大学生命学院,四川成都610064 [3]山西省农业生物技术研究中心,山西太原030031 [4]中国科学院成都生物研究所,四川成都610041

出　　处：《西北大学学报（自然科学版）》2002年第3期298-302,共5页Journal of Northwest University（Natural Science Edition）

基　　金：中国科学院生物科学与技术研究特别支持资助项目 (STZ- 1- 16 );山西省留学回国人员资助项目 (No.9810 15 );山西省财政厅科技支农资助项目 (No.980 0 3)

摘　　要：以高粱细胞质雄性不育系和保持系 A1Tx6 2 3 A/B,A2 V4 A/B为材料 ,考察了 Mg2 + ,Taq酶 ,d NTP,引物 ,模板等的用量、循环参数及不同的 PCR仪对随机扩增多态性 DNA(RAPD)反应的影响。结果发现 :在 2 5 μL体系中 ,Mg Cl2 2 .0 mmol/L,Taq酶 0 .75 U(1 U=1 μmol/min) ,d NTP0 .1 5mmol/L,引物 1 6 .5 ng,模板 3 0 ng,明胶 0 .0 0 1 % ,KCl5 0 mmol/L,Tris1 0 mmol/L(p H8.3 )为最佳反应混合物组合。对 Peltier Thermal Cycler 2 0 0而言 ,94℃预变性 5 min,94℃变性 1 min,3 5℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,最后 72℃保温 5 min,共计 40个循环为最佳扩增条件 ;对 Perkin ElmerCetus DNA Thermal Cycler- 480而言 ,采用 94℃预变性 3 min后 ,前 3个循环 ,94℃变性 1 min,3 5℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,后 3 7个循环 ,94℃变性 3 0 s,3 6℃退火 45 s,72℃延伸 1 min,最后72℃保温 5 min的循环程序可获得理想扩增。并阐述了优化 RAPD实验体系的设计原则。CMS sorghum A 1T x623A/B and A 1 V 4A/B as plant material were used in present experiment for optimizing the factors influencing RAPD reaction effect. The results showed that in a 25 μL reaction volume, the optimum mixture contained 2.0 mmol/L MgCl 2, 0.75 U Taq polymerase(MBI), 0.15 mmol/L dNTP, 16.5 ng primer, about 30 ng DNA, 0.001% Gelatin, KCl 50 mmol/L, and 10 mmol/L Tris (pH8.3). The optimum PCR reaction program, if amplification performed in Peltier Thermal Cycler 200, was after initial denaturation at 94℃ for 5 min, each of 40 cycles consisted of 94℃ 1 min, 35℃ 1 min, 72℃ 2 min, then final extention at 72℃ for 5 min. If amplification performed in Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480, the best program was after initial denaturation at 94℃ for 3min, the first 3 cycles contained 94℃ 30 s, 35℃ 45 s, 72℃ 1 min, the followed 37 cycles contained 94℃ 30s, 36℃ 45s, 72℃ 1 min, at last extention at 72℃ for 5 min. The principle of optimizing the RAPD reaction factors was described .

关 键 词：高梁 胞质雄性不育 保持系 RAPD技术 技术优化 实验设计 

分 类 号：S514[农业科学—作物学] Q945.3[生物学—植物学]