白木香倍半萜合酶基因AsSS4的克隆、原核表达与功能鉴定  

Cloning, prokaryotic expression, and functional identification of a sesquiterpene synthase gene(As SS4) from Aquilaria sinensis

作　　者：梁良[1,2] 郭庆梅[3] 张争[1,4] 徐艳红[1] 韩晓敏[5] 刘娟[1] 

机构地区：[1]中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所,北京100193 [2]聊城市人民医院,山东聊城252000 [3]山东中医药大学药学院,山东济南250012 [4]中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所海南分所海南省南药资源保护与开发重点实验室,海南万宁571533 [5]燕山大学环境与化学工程学院,河北秦皇岛066004

出　　处：《药学学报》2014年第12期1724-1729,共6页Acta Pharmaceutica Sinica

基　　金：国家自然科学基金资助项目(31000136,81173481);北京市自然科学基金资助项目(6102024);高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20091106120009);“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAI01B07);海南省中药现代化专项项目(2010ZY001,2012ZY002)

摘　　要：通过RT-PCR方法从伤害处理的白木香树木质部中克隆得到沉香倍半萜合酶4(sesquiterpene synthase 4,As SS4)基因的全长开放读码框,该基因全长读码框为1 698 bp,编码包含565个氨基酸的蛋白质。将As SS4基因与原核表达载体p ET28a相连构建重组载体p ET28a-As SS4,把重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S中,用IPTG诱导重组菌,经SDS-PAGE电泳分析,获得分子质量约为64 k D的重组As SS4蛋白。利用镍凝胶亲和色谱法获得纯度较高的As SS4蛋白,以法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行蛋白酶促反应,共催化产生5种倍半萜类成分:cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-elemene、α-guaiene、α-caryophyllene和δ-guaiene。本研究首次证实了白木香倍半萜合酶As SS4基因的功能,为揭示伤害诱导沉香倍半萜形成的分子机制奠定了理论基础。A sesquiterpene synthase （AsSS4） full-length open reading frame （ORF） cDNA was cloned from wounded stems of Aquilaria sinensis by RT-PCR method. The result showed that the ORF of AsSS4 was 1 698 bp encoding 565 amino acids. Prokaryotic expression vector pET28a-AsSS4 was constructed and transformed into E. coli BL21 （DE3） pLysS. Recombinant AsSS4 protein was obtained after induction by 1PTG and SDS-PAGE analysis with a MW of 64 kD. Enzymatic reactions using farnesyl pyrophosphate showed that recombinant AsSS4 protein purified by Ni-agarose gel yielded five sesquiterpene compounds, cyclohexane, 1-ethenyl-l-methyl-2, 4-bis（1-methylethenyl）-, β-elemene, a-guaiene, a-caryophyllene and δ-guaiene. This paper reported the first cloning and functional characterization of AsSS4 gene from A. sinensis, which will establish a foundation for future studies on the molecular mechanisms of wound-induce agarwood formation in A. sinensis.

关 键 词：白木香 倍半萜合酶基因 原核表达 基因功能 

分 类 号：R931[医药卫生—生药学]