热胁迫下棉花粉蚧内参基因的筛选  

Selection of reference genes in Phenacoccus solenopsis( Hemiptera:Pseudococcidae) under heat stress

作　　者：陈芳[1] 陆永跃[1] 

机构地区：[1]华南农业大学昆虫学系,广州510642

出　　处：《昆虫学报》2014年第10期1146-1154,共9页Acta Entomologica Sinica

基　　金：广东省自然科学基金项目(S2013010013526);广东省研究生教育创新计划项目(2013JDXM14)

摘　　要：【目的】筛选出热胁迫下棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis的实时定量PCR最适内参基因。【方法】本研究应用实时荧光定量PCR技术测定了棉花粉蚧2龄若虫、3龄若虫和雌成虫α-tub,β-tub,rpl32,GAPDH,SDHA和TBP共6个候选内参基因在7个不同温度处理(恒温18℃和32℃,以及37℃,39℃,41℃,43℃和45℃热激处理1 h并在26℃恢复1 h)下mRNA表达水平的稳定性;应用ge Norm,Bestkeeper,Normfinder和Ref Finder软件分析6个基因表达的稳定性。【结果】在不同高温胁迫下2龄若虫6个候选内参基因的稳定值M由小到大依次为α-tub(0.579)<GAPDH(0.654)<TBP(0.663)<β-tub(0.668)<rpl32(0.675)<SDHA(0.755),SD值排序为TBP(0.31)<α-tub(0.37)<rpl32(0.38)<SDHA(0.52)<β-tub(0.53)<GAPDH(0.57);3龄若虫6个候选内参基因的稳定值M由小到大依次为α-tub(0.542)<β-tub(0.596)<TBP(0.618)<GAPDH(0.655)<SDHA(0.668)<rpl32(0.749),SD值排序为α-tub(0.29)<β-tub(0.40)<rpl32(0.45)<TBP(0.49)<GAPDH(0.50)<SDHA(0.55);雌成虫6个候选内参基因的稳定值M由小到大依次为rpl32(0.554)<α-tub(0.635)<GAPDH(0.662)<β-tub(0.666)<SDHA(0.704)<TBP(0.837),SD值排序为rpl32(0.31)<α-tub(0.35)<GAPDH(0.44)<TBP(0.44)<β-tub(0.48)<SDHA(0.71)。Ref Finder综合排序结果表明,在7个不同温度处理下2龄若虫和3龄若虫中α-tub最稳定,雌成虫中rpl32最稳定。【结论】α-tub可作为棉花粉蚧2龄若虫和3龄若虫的内参基因,rpl32可作为雌成虫的内参基因。本结果为进一步开展热胁迫下棉花粉蚧热激蛋白基因的表达规律研究提供了参照。[ Aim] To select the suitable reference genes in Phenacoccus solenopsis after exposure to different temperature stress by using quantitative real-time PCR （RT-qPCR）. [ Methods ] In this study, we investigated the mRNA expression stability of six candidate reference genes （a-tub, GAPDH, rpl32, β-tub, SDHA and TBP） in different developmental stages （2nd instar nymph, 3rd instar nymph and female adult） of P. solenopsis under seven different temperature regimes （constant temperature 18 ℃ and 32℃, and temporary heat shock （1 h） at 37℃, 39℃, 41℃, 43℃ and 45℃ and then recovery at 26℃ for 1 h） by RT-qPCR method. Three software-based approaches （geNorm, Bestkeeper and Normfinder） and one web-based comprehensive tool （RefFinder） were used to analyze and rank the tested genes, and evaluate the expression stability of these genes. [ Results ] In the 2nd instar nymphs, the M values of six reference genes stability in the ascending order were a-tub （0. 579 ） 〈 GAPDH （0. 654） 〈 TBP （0. 663 ） 〈β-tub （0.668） 〈 rp132 （0. 675） 〈 SDHA （0. 755）, and the SD values were TBP （0.31） 〈 a-tub （0.37） 〈 rpl32 （0.38） 〈SDHA （0.52） 〈β-tub （0.53） 〈GAPDH （0.57）. In the 3rd instar nymphs, the M values in the ascending order were a-tub （0. 542） 〈β-tub （0. 596） 〈 TBP （0. 618） 〈 GAPDH （0.655） 〈 SDHA （0. 668） 〈 rpl32（0.749）, while the SD values were a-tub （0.29） 〈β-tub （0.40） 〈 rp132 （0.45） 〈 TBP （0.49） 〈 GAPDH （0.50） 〈 SDHA （0.55）. The M values in female adults in the ascending order were rpl32 （ O. 554 ） 〈 a-tub （ O. 635 ） 〈 GAPDH （ O. 662 ） 〈 B-tub （ O. 666 ） 〈 SDHA （0.704） 〈TBP （0.837）, and the SD values were rpl32 （0.31） 〈a-tub （0.35） 〈GAPDH （0.44） 〈SDHA （0.44） 〈β-tub （0.48） 〈 TBP （0.71）. According to the comprehensive rank of RefFinder, a-tub was the most stable for the 2nd and 3rd instar nymph,

关 键 词：棉花粉蚧 温度 热胁迫 内参基因 表达稳定性 实时荧光定量PCR 

分 类 号：Q966[生物学—昆虫学]