草莓轻型黄边病毒RT-LAMP检测方法的建立  

Detection of Strawberry mild yellow edge virus by RT-LAMP

作　　者：陈柳[1] 尚巧霞[1] 陈笑瑜 邢冬梅 冉策 魏艳敏[1] 赵晓燕[1] 刘正坪[1] 

机构地区：[1]北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206 [2]北京市植物保护站,北京100029 [3]北京市昌平区植保植检站,北京102200

出　　处：《中国农业科学》2015年第3期613-620,共8页Scientia Agricultura Sinica

基　　金：北京市教育委员会科技计划面上项目(KM201210020003);青年拔尖人才培育计划(CIT&TCD201304091)

摘　　要：【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC-3′)、SMYEV-F3(5′-TCAAGTTGGTGACCCTTTCC-3′)和SMYEV-B3(5′-CGAGGAAC CAATGTCGTAGC-3′)。对RT-LAMP检测体系中的条件进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,反应时间为30、45、60、75 min,分别设置引物SMYEV-FIP/BIP浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μmol·L-1,引物SMYEV-F3/B3浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μmol·L-1,设置Mg2+浓度为2、4、6、8、10 mmol·L-1,d NTPs浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol·L-1,betaine浓度为0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1,DTT浓度为2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0μmol·L-1等,并对以上不同反应条件进行检测,确定优化后的RT-LAMP检测体系。选用其他常见的草莓病毒以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板,对RT-LAMP体系的特异性进行测定;将SMYEV的RNA进行10倍梯度逐级稀释,分别获得RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同稀释液作为模板,比较RT-LAMP和RT-PCR的检测灵敏度。RT-LAMP反应产物可以进行电泳和紫外成像检测,阳性样品出现瀑布状条带,阴性样品无条带,或者在反应产物中加入SYBR green I核酸染料,直接观察检测,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了一种特异性检测SMYEV的RT-LAMP方法,经过各反应条件优化后的检测体系为1.0μmol·L-1SMYEV-FIP/BIP、0.1μmol·L-1 SMYEV-F3/B3、4 mmol·L-1 Mg2+、1.6 mmol·L-1 d NTPs、0.4 mol·L-1 betaine、2.0μmol·L-1DTT,60℃反应45 min。选用SMYEV、草莓镶脉病毒(Strawberry vein ban【Objective】Strawberry mild yellow edge virus（SMYEV） is an important virus infecting strawberry plants, reducing fruit yield and quality. The objective of this study is to establish an effective method to detect SMYEV using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）. 【Method】 Four specific RT-LAMP primers for SMYEV detection including SMYEV-FIP（5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′）, SMYEV-BIP（5′-GCTTTGTCGGGGATC CTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC-3′）, SMYEV-F3（5′-TCAAGTTGGTGACCCTTTCC-3′） and SMYEV-B3（5′-CGAGG AACCAATGTCGTAGC-3′） were designed according to the published 3′ end conservative sequences of SMYEV CP gene. Different reaction temperatures（60, 61, 62, 63, 64, 65℃）, reaction times（30, 45, 60, 75 min）, concentrations of primers SMYEV-FIP/BIP（1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 μmol·L-1） and SMYEV-F3/B3（0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 μmol·L-1）, Mg2＋（2, 4, 6, 8, 10 mmol·L-1）, d NTPs（0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 mmol·L-1）, betaine（0, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 mol·L-1） and DTT（2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0 μmol·L-1） were used and optimized in the RT-LAMP in order to improve specificity and sensitivity of the detection. The specificity of RT-LAMP was tested by using different RNA templates from other important strawberry viruses and healthy leaves of strawberry plants. The sensitivities of RT-LAMP and RT-PCR for detecting SMYEV were compared by using ten-fold serially diluted RNA templates of SMYEV（including original RNA, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 and 10-7 dilution）. The RT-LAMP products could be detected by electrophoresis and ultraviolet image technology, the typical ladder-like pattern was observed in the positive samples while no amplification of DNA was visible in the negative samples. The RT-LAMP products could be also evaluated by adding SYBR green I, the color of the product for the positive reaction changed from orange to green while the product for a negative reaction remained orange.【R

关 键 词：草莓轻型黄边病毒 反转录等温扩增技术 检测 

分 类 号：S436.68[农业科学—农业昆虫与害虫防治]