香石竹茎尖的改良小液滴玻璃化法超低温保存  

Cryopreservation of Carnation(Dianthus caryophyllus L.) Shoot-tips by Modified Droplet-Vitrification Technique

作　　者：林田[1] 杨华[1] 李天菲[1] 刘灶长[1] 罗利军[1] 

机构地区：[1]上海市农业生物基因中心,上海201106

出　　处：《农业科技与信息（现代园林）》2015年第4期322-323,共2页Modern Landscape Architecture

基　　金：上海市科技兴农重点攻关项目;编号沪农科攻字(2006)第1-8号;上海市科委研发平台专项"上海市农作物种质资源共享服务平台"

摘　　要：香石竹（Dianthus caryophyfllus L.）为石竹科石竹属常绿亚灌木花卉,是世界著名的切花之一,其栽培种及野生种的资源有效保存对香石竹的国产化至关重要。超低温保存（-196℃）是无性繁殖的植物种质资源最安全经济的保存方法。超低温保存方法中常用的为玻璃化法,近年来在传统玻璃化法上发展出来小液滴法,即将植物材料经玻璃化处理后,在铝箔上滴成小液滴,后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于冻存及解冻速度快,组织不易形成冰晶,易成活再生,是一有发展前景的方法。超低温保存中,茎尖大小及结构的完整性对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。我们以香石竹为模式植物,结合包埋法及小液滴法的特点,对相关技术进行改进,探索一种适用于植物茎尖超低温保存方法及冷冻植株后再生的技术。试材为香石竹红花品种,从上海花卉市场购买。切取花茎繁殖试管苗,获得花茎无性繁殖系。取组培继代3个月以上的无菌组培苗。茎尖超低温保存的试验方法为：1、常规玻璃化法：（1）剥取1～2mm无菌苗茎尖,接种到含0.3 mol·L-1蔗糖浓度的MS培养基中,在25℃下培养1～3d;（2）经预培养后,将茎尖置于含预处理液（含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培养液）的2ml冷冻管中,于室温下处理60min,然后将预处理液吸出,换入预冷玻璃化保护剂PVS2中在冰浴中处理60～120min;（3）冷冻管换入预冷新鲜PVS2约0.5ml,迅速投入液氮中保存。解冻取出在液氮中冻存1 h以上的冷冻管,立即放入40℃水浴中快速解冻2 min。（4）茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3次,每次5～10 min。（5）洗涤后的茎尖在滤纸上吸干后,转移至恢复培养基中暗培养,等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中常光培养。2、小液滴法：步骤（1）、（2）同常规玻璃化法;（3）在冻存前5min将�This paper developed a modified technique ofdroplet-vitrification for shoot tips cryopreservation of Dianthus caryophyllus L.（1） Shoot-tips（1～2mm） were carefully dissected and adhered to filter paper slips（3mm×20mm） by 2% Na-alginate solution with 0.3Msucrose in calcium-free MS basal medium.（2）The filter paper slips contain shoot-tips（FPCS） then were immersed in 0.1% calcium solutionto achieve polymerization.（3） Incubated for 10 min, FPCS were pre-cultured on medium with 0.3M sucrose for 1～3d.（4）After pre-culture, FPCS were put into the Loading solution（containing 2.0Mglycerol and 0.4 M sucrose） for 60 min at room temperature and changed to PVS2 on ice for 60～120min.（5） After dehydration, FPCS were directly plunge into LN. Forlong-term storage, transfer FPCS to the cryotube containing LN, then capped and stored in LN tank.（6） For regeneration, FPCS were taken out of cryotube and immersed in 1.2 M sucrose solution for 20 min at room temperature.（7） FPCS were dried on sterile filter paper andtransferred onto recovery medium. The rate of survival and regeneration were both above 80% when evaluated after 4 weeks of culture.

关 键 词：种质资源 香石竹 茎尖 改良小液滴法 超低温保存 

分 类 号：S-3[农业科学]