黑莓果实UGT78H2重组蛋白诱导的响应面优化与蛋白纯化  

Optimization of Prokaryotic Expression Factors for Blackberry UGT78H2 Using Responsive Surface Methodology and Protein Purification

作　　者：陈清[1] 江雷雨[1] 王燕[1] 朱芳莉[1] 汤浩茹[1] 王小蓉[1,2] 

机构地区：[1]四川农业大学园艺学院,雅安625014 [2]四川农业大学果蔬研究所,成都611130

出　　处：《植物研究》2015年第5期724-729,共6页Bulletin of Botanical Research

基　　金：四川省教育厅自然科学重点项目(13ZA0244);国家自然科学基金(31272134);教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20125103110005)

摘　　要：UGT78H2是从黑莓果实中新发现的一个植物糖基转移酶家族成员,获得重组蛋白是后续深入研究该基因功能的基础。本研究通过构建原核表达载体,并应用响应面分析方法对重组蛋白的诱导条件(如诱导温度、IPTG浓度、菌液浓度和诱导时间)进行了优化,结果表明:(1)构建了p ET32a-UGT78H2原核表达载体,并成功导入到BL21(DE3)p Lys S细菌中;(2)经响应面优化,在29.5℃培养工程菌至菌液OD600=0.51,加入终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG诱导7.4 h,可获得最大量重组蛋白166.4μg·m L-1(占总蛋白41.6%);(3)诱导时间和培养温度极显著地影响重组蛋白表达量,诱导剂IPTG和诱导前菌液浓度之间的交互效应显著影响重组蛋白的表达;(4)获得的带S-tag和His-tag的UGT78H2重组蛋白分子量为67.9 k Da,主要以包涵体形式存在,通过Ni-NTA柱纯化,成功获得了重组蛋白。以上结果为进一步采用酶学方法进行UGT78H2蛋白功能鉴定提供了基础资料。UGT78H2 is a newly discovered glycosyhransferase from blackberry fruit, and the successfully obtained protein is the basis for further functional characterization. We constructed a prokaryotic expression vector and optimized the induction factors （induction temperature, cell and II：＇FG concentration, and induction duration） using responsive surface methodology （ RSM ）. （ 1 ） the constructed pET32a-UGT78H2 plasmid was successfully transformed into the bacteria BL21 （ DE3 ） pLysS ; （2）By RSM, incubating at 29.5℃ till cell OD600 = 0.51, IPTG was added to the final concentration of 0.4 mmol · L- 1 to incubate for 7.4 hours, and the most quantities of recombinant UGT78H2 was obtained （ 166.4 μg · mL-1 ） ; （ 3 ） Incubation temperature and the length of culture time extremely significant affected the overall quantities of protein, and IPTG concentration and cell OD interactively determined the recombinant protein at significant level; （4）The recombinant protein was 67.9 kDa in molecular weight, existing as inclusion bodies in most fraction, and purified by utilizing Ni-NTA affiliation column system.

关 键 词：黑莓 UGT78H2 原核表达 响应面分析 重组蛋白 

分 类 号：S663.23[农业科学—果树学]