改良超高效液相色谱串联质谱法测定25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D  

Improved method for the determination of serum 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

作　　者：禹松林[1] 方慧玲[1] 张瑞苹 程歆琦[1] 韩建华[1] 苏薇[1] 程倩[1] 侯立安[1] 姜小梅 邱玲[1] 

机构地区：[1]中国医学科学院北京协和医院检验科,北京100730 [2]中日友好医院检验科,北京100029 [3]美国ABSCIEX公司北京代表处,北京100015

出　　处：《检验医学》2015年第10期1021-1026,共6页Laboratory Medicine

基　　金：国家"863"计划资助项目(2014AA022304);国家自然科学基金资助项目(81201337;81171665);国家临床重点专科资助项目

摘　　要：目的建立可同时区分3-epi 25-羟基维生素D3[3-epi 25（OH）D3]、25-羟基维生素D3[25（OH）D3]和25-羟基维生素D2[25（OH）D2]的改良超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）。方法采用甲醇、硫酸锌沉淀蛋白,以稳定同位素为内标,正己烷提取,色谱采用甲醇和水以一定比例进行梯度洗脱,质谱采用正离子条件下多离子反应监测模式,3-epi 25（OH）D3和25（OH）D3的定量离子通道质荷比（mass to charge,m/z）均为413.3→395.3,25（OH）D2的m/z为401.4→383.4;同位素内标25（OH）D2-d3和25（OH）D3-d3的m/z分别为416.3→398.3和404.4→386.4。25（OH）D3和25（OH）D2分别以各自的标准品和同位素内标制作标准曲线;3-epi 25（OH）D3采用25（OH）D3的标准曲线和内标。评价方法的线性、精密度和准确度等,同时用本法和常规UPLC-MS/MS测定307例临床样本,考察方法的一致性,判别3-epi 25（OH）D3对常规UPLC-MS/MS测定结果的影响。结果本法可在13 min内将3-epi 25（OH）D3、25（OH）D3和25（OH）D2完全区分开,3种物质互不干扰,线性相关系数（r）〉0.999,25（OH）D3总变异参数（CV）的均值（范围）为2.82%（2.45%~3.21%）,批内CV为1.82%（1.76%~1.91%）;25（OH）D2总CV的均值（范围）为4.34%（2.88%~7.01%）,批内CV为2.62%（1.91%~3.66%）。25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi 25（OH）D3的准确度分别104.5%~106.8%、98.9%~106.9%、108.0%~109.9%。随机测定307例临床样本,结果显示样本3-epi 25（OH）D3浓度均在3.0 ng/m L以下,本法和常规UPLC-MS/MS分析25-羟基维生素D[25（OH）D]的结果分别为15.53±8.58和（15.98±9.08）ng/m L,偏差为-0.46 ng/m L,百分偏差为-2.44%,2种方法的结果差异无统计学意义（t=0.631,P=0.53）,R2=0.978。用本法测定得到的维生素D不足、缺乏和充足率分别为76.9%、14.3%、8.8%,常规法的结果分别为75.6%、15.3%、9.1%,2种方法对临床判定的一致率达94.1%,3-epi 25（OH）D3对临床常规UPLC-MS/MS�Objective To establish a method for the determinations of serum 3-epi 25-hydroxyvitamin D3[3-epi 25（ OH） D3],25-hydroxyvitamin D3 [25（ OH） D3] and 25-hydroxyvitamin D2 [25（ OH） D2] by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry（ UPLC-MS / MS）. Methods Serum samples were mixed with internal standard [25（ OH） D2-d3 and 25（ OH） D3-d3]and treated with methanol and Zn SO4 solution to precipitate protein,and then extracted with hexane. Gradient elution with methanol and water was used in chromatography,and chromatography system was in the positive electro-spray ionization mode and multiple reaction monitor mode,and the transitions used for each analyte were： 3-epi 25（ OH） D3 to 25（ OH） D3 mass to charge（ m / z） 413. 3→395. 3,3-epi 25（ OH） D3 to 25（ OH） D2 m/z 401. 4→383. 4,25（ OH） D2-d3 m/z 416. 3→398. 3 and 25（ OH） D3- d3 m/z 404. 4→386. 4. 25（ OH） D3 and 25（ OH） D2 were quantified by internal standard and standard curves. The quantification of3-epi 25（ OH） D3 used the same internal standard and standard curves as 25（ OH） D3. The linearity,precision and accuracy were evaluated. A total of 307 samples were determined by this method and routine UPLC-MS / MS established early to evaluate consistency and the influence of 3-epi 25（ OH） D3 on routine UPLC-MS / MS. Results By this method,serum 3-epi 25（ OH） D3,25（ OH） D3 and 25（ OH） D2 were separated and quantified in 13 min. The linearity correlation coefficients（ r） were 〉 0. 999. The total and within-run coefficients of variation（ CV） of 25（ OH） D3 were2. 82%（ 2. 45%-3. 21%） and 1. 82%（ 1. 76%-1. 91%）. For 25（ OH） D2,they were 4. 34%（ 2. 88%-7. 01%） and2. 62%（ 1. 91%-3. 66%）. The accuracies of 25（ OH） D2,25（ OH） D3 and 3-epi 25（ OH） D3 were 104. 5%-106. 8%,98. 9%-106. 9% and 108. 0%-109. 9%,respectively. In all the 307 patients,the concentration of 3-epi 25（ OH） D3 was less than 3 ng / m L. The means of this me

关 键 词：25-羟基维生素D 3-epi 25-羟基维生素D3 液相色谱串联质谱法 

分 类 号：R446.1[医药卫生—诊断学]