肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定  

Identification of the Transcriptional Activity Domain of EV71 3D^(pol)

作　　者：徐骁 姚云芳 李靖 柴克莉 乔文涛[1] 谈娟[1] 

机构地区：[1]南开大学分子微生物与技术教育部重点实验室,南开大学生命科学学院,天津300071

出　　处：《病毒学报》2016年第5期560-565,共6页Chinese Journal of Virology

基　　金：“973”计划(项目号:2013CB911100),题目:重要病毒转录复制蛋白复合体的结构功能研究

摘　　要：EV71是导致手足口病的主要病原体之一,其3D聚合酶作为依赖于RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中发挥重要作用。当前,3D与宿主细胞的相互作用鲜有研究。酵母双杂交实验是研究蛋白质相互作用成熟有效的方法。本文将3D基因克隆至pGBKT7载体,构建了用于酵母双杂交实验的诱饵质粒,鉴定正确后转化酵母细胞AH109,依次检测了3D蛋白的表达、细胞毒性和自激活能力,结果表明3D基因可在AH109菌株中表达,对后者生长无显著影响,但融合蛋白具有自激活能力。进一步构建一系列含3D蛋白截短体的诱饵质粒,通过自激活实验界定了3D的最小转录激活域(1~94aa),为后续利用酵母双杂交技术研究与3D相互作用的细胞蛋白奠定了基础。Enterovirus 71（EV71）is one of the major pathogens of hand,foot and mouth disease（HFMD）.The EV71 genome encodes an RNA-dependent RNA polymerase（RdRp）,3D^（pol）,which is critical for genome transcription and translation.However,how the 3D^（pol） interacts with the host remains unclear.Yeast two-hybrid systems provide an effective approach for detecting protein-protein interactions.In this report,we inserted the DNA sequence of 3D^（pol） into the pGBKT7 vector as the bait plasmid for the yeast two-hybrid experiment and transformed the plasmid into the yeast AH109 strain.We detected the expression,cytotoxicity and self-activity of 3D^（pol）.The 3D^（pol） expressed well without affecting cell growth but exhibited strong transcriptional activation in yeast cells.We further constructed a series of pGBKT7-3D（pol） deletion mutants and identified the shortest transcriptional activation domain（1-94aa）using a self-activation assay.The results provide a molecular basis for screening the host proteins that interact with 3D（pol） using the yeast twohybrid system.

关 键 词：EV71 3D聚合酶 酵母双杂交 

分 类 号：R373.2[医药卫生—病原生物学]