基于多肽阵列技术构建穿膜肽靶向抑制Fyn与突触后致密物蛋白95相互作用的实验研究  

Cell-penetrating peptide based on peptide array technique inhibits interaction between Fyn and postsynaptic density protein95 in vitro

作　　者：杨秀环[1] 马彤彤[2] 李舒愉 贾济[2] 彭捷[2] 陆建华[2] 屠伟峰[2] 

机构地区：[1]徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室、江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室,221004 [2]广州军区广州总医院麻醉科、全军临床麻醉中心,510010

出　　处：《国际麻醉学与复苏杂志》2016年第10期865-870,共6页International Journal of Anesthesiology and Resuscitation

基　　金：国家自然科学基金（81371233）

摘　　要：目的探讨基于多肽阵列技术合成的穿膜肽离体条件下抑制非受体酪氨酸激酶Fvn与突触后致密物蛋白（postsynaptic density protein，PSD）95相互作用，进而抑制含N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（N-methyl D-aspartate receptor subtype2B，NR2B）的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl D-aspartate receptor，NMDAR）过度磷酸化，减轻慢性疼痛的可行性。方法①通过多肽阵列技术的overlapping平台确定Fyn的SH2结构域与PSD95的PDZ3结构域相互作用的结合基序，合成含此结合基序的短肽FynP，并与人类免疫缺陷病毒human immunodeficiencv virus，HIV）．Tat蛋白转导结构域连接形成可进入细胞的穿膜肽FynP-Tat，同时合成乱序穿膜肽mFynP-Tat。②原代培养sD大鼠胎鼠脊髓背角神经元，通过免疫荧光检测不同浓度组（10、20、30μmol/L）多肽内化细胞的效率。③用CCK8法检测不同浓度（10、20、100μmol／L）穿膜肽分别孵育神经细胞（6、24、48h）的细胞毒性。④将神经细胞分为穿膜肽组（FynP-Tat组）、乱序穿膜肽组（mFynP-Tat组）和PBS组（对照组）进行孵育，用谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST）pull-down和Western blot验证抑制Fvn与PSD95相互作用的效率。结果①通过overlapping确定Fyn与PSD95相互作用的结合基序为KGAYSL。②与FynP-Tat10μmol／L组[（77．3±1．4）％]比较，FvnP-Tat20μmol／L组[（91．5±2．0）％]和FvnP-Tat30μmol／L组[（93．4±2．2）％]的内化效率较高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与mFynP-Tat10μmol／L组[（75．0±3．6）％]比较，mFynP-Tat20μmol／L组[（91．4±1．3）％]和mFynP-Tat30μmol／L组[（92．7±2．1）％]的内化效率较高，差异有统计学意义（P〈0．05）；③与FynP-Tat（100μmol／L，6h）组[（82．5±3．0）％]比较，FynP．Tat（100μmol／L，24h）组和FynP-Tat（100μmol／L，48h）组细胞活力[（75．1±1．5）％和（68．5±1．2）％]降Objective To examine the potential application of the cell-penetrating peptide based on peptide array for the inhibition of interaction between the nonreceptor tyrosine kinase Fyn and post density protein postsynaptic density protein （PSD） 95 in vitro. Methods First, by using peptide array we identified binding motif （FynP） between Fyn SH2 domain and PSD95 PDZ3 domain. We fused Fynp with the transduction domain of the human immunodeficieney virus （HIV）-Tat protein to generate the cell- penetrating peptide （FynP-Tat）, and generate a mistake sequence of cell-penetrating peptide （mFynP-Tat）. Second, we cultured the spinal dorsal horn neurons isolated from the embryonic Sprague-Dawley rats, and investigated the internalization efficiency of peptides by immunofluorescence staining in different concentration groups（10, 20, 30 μmol/L）. Third, we calculated the cytotoxicity of the cell-penetrating peptides through CCK8 in different concentrations（lO, 20, 100 μmol/L） and different incubating time groups（6, 24, 48 h）. Fourth, we investigated the interruption efficiency of FynP-Tat on the interaction between Fyn and PSD95 by using GST pull- down and Western blotting, and neurons were incubated by FynP-Tat（Fynp-Tat group）, mFynP-Tat（mFynP-Tat group） and PBS（control group）. Results ① Peptide array showed that the binding motif between Fyn and PSD95 was KGAYSL. ② FynP-Tat 20 μmol/L group [ （91.5±2.0）% ] and FynP-Tat 30 μmol/L group [（93.4：1：2.2）% ] internalized neurons significantly, compared with the cells exposed to FynP-Tat 10 μmol/L group[（77.3±l.4）% ]（P〈0.05）, mFynP-Tat 20 μmol/L group[（91.4±l.3）% ] and mFynP-Tat 30 μmol/L group[（92.7±2.1）% ] internalized neurons singnificantly, compared with the cells exposed to mFynP-Tat 10 μmol/L group[（75.0±3.6）% ] （P〈O.05）. ③ After an incubation of 100 μmol/L FynP-Tat for 24 h and 48 h, the cell viability was decreased to [（75.1±1.5）% and （68.5±1.2）%], compared with[（82

关 键 词：蛋白转导结构域 N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基 多肽阵列 结合基序 

分 类 号：R614[医药卫生—麻醉学]