蛋白质异戊二烯化关键酶GGPPS结合小分子筛选模型的构建  

The Construction of Mevalonate Pathway Enzyme GGPPS Protein Binding Molecules Screening Model

作　　者：齐雅玲 卢悟广 种丹阳 刘佳 孙倩 徐晓军[3] 曹鹏[2] 方雷 李朝军[1] 薛斌[1] 

机构地区：[1]南京大学医学院、医药生物技术国家重点实验室、江苏省医学分子技术重点实验室,江苏南京210093 [2]江苏省中西医结合医院,江苏南京210028 [3]中国药科大学、天然药物活性组分与药效国家重点实验室,江苏南京210009

出　　处：《南京师大学报（自然科学版）》2017年第4期87-92,共6页Journal of Nanjing Normal University(Natural Science Edition)

基　　金：国家自然科学基金(31371373);江苏省自然科学基金(BK20151395);天然药物活性组分与药效国家重点实验室开放基金(SKLNMKF201606);中央高校基本科研业务费专项资金(021414380330)

摘　　要：蛋白质的基本翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、乙酰化、棕榈酸化等^([1]),而异戊二烯化修饰是蛋白质的基本翻译后修饰之一,属于蛋白质的脂质修饰^([2]).甲羟戊酸途径中的关键分支酶——香叶基香叶基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)能够催化法尼基焦磷酸盐(Farnesyl diphosphate,FPP)生成香叶基香叶基焦磷酸盐(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP),介导蛋白质异戊二烯化的平衡^([3]).导致包括胰岛素抵抗^([4])、胰岛功能失调^([5])、生殖代谢异常^([6])等各种疾病的发生.GGPPS作为调节蛋白质异戊二烯化的重要靶点,因其在调节机体能量代谢稳态中的重要作用,促使构建筛选模型得到靶向GGPPS的小分子治疗药物,具有重要实践意义.实现EGFP荧光标记GGPPS原核蛋白的纯化以及表达,结合微量热泳动技术进行GGPPS结合天然化合物小分子的筛选模型构建.根据筛选模型对于检测蛋白稳定荧光的要求,分别构建含有GGPPS和EGFP基因的重组pET28a质粒以及对照质粒pET28a-EGFP.筛选高水平分泌表达GGPPS-EGFP-His蛋白的菌株,并对该菌株的目的基因整合位置及拷贝数进行测序.将含有目的基因的重组质粒的BL-21菌株大规模培养,表达的目的蛋白上带有His标签,利用镍(Ni)柱的亲和层析原理纯化获得重组蛋白GGPPS-EGFP-His,测定蛋白浓度留存.随后基于微量热泳动技术进行小分子结合筛选.重组GGPPS蛋白与梯度浓度化合物小分子在红外激光作用下发生热泳动,通过中心区域荧光检测可得出GGPPS与小分子化合物的结合状况.重组表达质粒GGPPS-EGFP-His经电泳及测序鉴定构建正确.纯化获得的重组蛋白纯度约为80%,在微量热泳动实验中,经GGPPS底物小分子法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)浓度梯度测试呈现良好结合.重组蛋白GGPPS-EGFP-His能够在微量热泳动技术下显示与小分子底物FPP的结合,该系统的构建对于筛�The post translational modifications of proteins include phosphorylation,glycosylation,acetylation,palmitic acid and so on. And the prenylation modification of proteins is one of the basic post translational lipid modifications of proteins. The key enzyme of mevalonate pathway,GGPPS,can catalyze FPP to generate GGPP and mediate the equilibrium of protein prenylation,affect disease progression including insulin resistance,hyperyension,abnormal reproductive metabolism. Hence,it has an important practical significance that construct a GGPPS interaction model to obtain its molecule therapeutic drugs. Obtain the high expression of EGFP fluorescent labeled GGPPS prokaryotic purified protein. Construct a GGPPS interaction model with microscale thermophoresis technology. The recombinant expression plasmid GGPPS EGFP His was constructed correctly verified by gel electrophoresis and sequencing verification.The purified recombinant protein reached a purity of about 80%. In the microscale thermophoresis assay,the GGPPS substrate farnesyl pyrophosphate concentration gradient test showed a good combination.

关 键 词：GGPPS重组蛋白 微量热泳动 小分子筛选 

分 类 号：Q291[生物学—细胞生物学]