小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用  

The effect of AmpD on the expression of AmpC β-lactamase and the regulation mechanisms of β-N-acetylglucosaminidase in Yersinia enterocolitica

作　　者：张婧[1] 梁俊容[1] 段然[1] 秦帅 肖萌 景怀琦[1] 王鑫[1] Zhang Jing;Liang Junrong;Duan Ran;Qin Shuai;Xiao Meng;Jing Huaiqi;Wang Xin(National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

机构地区：[1]中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206

出　　处：《中华预防医学杂志》2018年第6期653-660,共8页Chinese Journal of Preventive Medicine

基　　金：国家自然科学基金（81470092、31500117）

摘　　要：目的 研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）的调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用.方法 通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物（AmpD1～3）基因（ampD1～3）、低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）基因（pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7）、NagZ基因（nagZ）以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpCβ-内酰胺酶活性（单位为U）,采用luxCDABEreporter系统检测AmpCβ-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位（RLU）],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性（单位nmol/L）.结果 AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpCβ-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为（3.29±1.58）和（4.08±1.75）U.YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为（106903.16±61910.61）和（205427.45±45352.17）RLU.缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（304108.04±99274.53）和（531440.21±68891.02）RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（1013810.99±260955.96）和（1230214.59±205526.79）RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpCβ-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为（0.30±0.20）和（0.29±0.21）U,基本降至野生株水平.结论 在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调�Objective In this study, we analyze the regulation mechanisms of the expression of ampD in AmpCβ-lactamase and the regulation mechanism ofβ-N-acetylglucosaminidase （NagZ） in Yersinia enterocolitica. Methods We construct the mutation strains of Yersinia enterocolitica AmpD （AmpD1-3） gene （ampD1-3）, Low-Molecular-Mass Penicillin-Binding Proteins （LMM PBPs） gene （pbp4, pbp5a, pbp5b, pbp7）, NagZ gene （nagZ）, and ampR gene by deleting and complementing genes, and induce them by cefoxitin. We determined the activity of AmpC β-lactamase activity （U） of mutant strains （basal level and induce level） by using cephalothiophene hydrolysis method, the promoter activity of AmpC β-lactamase （（relative light unit （RLU）） was detected by the luxCDABEreporter system, and the activity ofβ-N-acetylglucosaminidase （nmol/L） was determined by by using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as the chromogenic substrate. Results AmpD1 （Basal level：（3.29±1.58） U;Induced level：（4.08±1.75） U） was the most potent one. The YEΔ5b,YEΔ4Δ5b, YEΔ5aΔ5b and YEΔ5bΔ7 of ampC promoter activity increase significantly, whichYEΔ4Δ5b is the highest one （Basal level： （106903.16 ± 61910.61） RLU;Induced level： （205427.45 ± 45352.17） RLU）. The YEΔ4Δ5bΔ7 of ampC promoter activity is the highest among triple mutant strain （Basal level： （304108.04 ± 99274.53） RLU;Induced level： （531440.21 ± 68891.02） RLU）. Quadruple deletion strain YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7 have the highest ampC promoter activity （Basal level： （1013810.99 ± 260955.96） RLU;Induced level： （1230214.59 ± 205526.79） RLU）. After the deletion of nagZ gene, there is no significant change in β-lactamase activity of YEΔD1D2D3ΔZ, whileβ-lactamase activity of YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ shows a significant decrease （Basal level： （0.30 ± 0.20） U;Induced level：（0.29 ± 0.21） U）, which basically drops to the wild strain level. Conclusion This is the first report of ampC mu

关 键 词：耶尔森菌 小肠结肠炎 青霉素结合蛋白质类 N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶 氨苄青霉素头孢菌素酶 β-N-乙酰葡萄糖胺酶 

分 类 号：R446.5[医药卫生—诊断学]