利用epiCRISPR载体表达双sgRNA实现高效的HDAC基因编辑  

The Episomal Vector-based CRISPR/Cas9 System with Paired gRNAs for highly Efficient HDAC Gene Knockout

作　　者：王子实 李苗苗 王永明[1] WANG Zishi;LI Miaomiao;WANG Yongmin(School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200438,China)

机构地区：[1]复旦大学生命科学学院,上海200438

出　　处：《复旦学报（自然科学版）》2018年第4期412-421,共10页Journal of Fudan University：Natural Science

基　　金：国家自然科学基金(81370302)

摘　　要：CRISPR/Cas9技术是广泛使用的一种基因编辑技术,它包括Cas9和gRNA 2个元件.具有内切酶活性的Cas9能够通过gRNA识别并切断目标DNA序列.细胞主要通过非同源末端连接途径修复DNA,这是一个容易产生indel的修复途径,理论上有近2/3概率产生移码突变,可以用于基因敲除.很多癌细胞系和体外培养的细胞系基因拷贝数增加了,同时敲除所有拷贝的难度增大,因此有必要开发一种高效的基因敲除方法.本实验室在前期工作中利用附着体载体表达的Cas9和gRNA,可以高效地产生indel,称为epiCRISPR系统.在本研究中,我们用epiCRISPR系统同时表达2个gRNA,可以在目标基因上删除一段DNA序列,其长度不是3的倍数,这样可以高效地产生移码突变.HDAC(histone deacetylase)基因家族编码一类负责组蛋白去乙酰化的蛋白酶,对细胞生长有重要影响,敲除难度较大.我们利用附着体载体表达双gRNA的技术成功地得到了HDAC1、HDAC2和HDAC6纯合敲除细胞系.CRISPR/Cas9 is a widely used genome editing technology,which contains two fundamental elements：Cas9 protein and gRNA.Cas9 recognizes and cuts target DNA by using gRNA.The majority of the double-strand DNA breaks is repaired by non-homologous end joining（NHEJ）,an error-prone pathway resulting in indels.This pathway can be used to knockout genes,because two thirds of indels can cause frameshift mutations.Some cancer cell lines and cultivated cell lines have multiple gene copies,which is difficult to knockout all copies.Therefore,a more efficient gene knockout method is required.In the prior study,we used episomal vector to express Cas9 and gRNAs（entitled epiCRISPR）,enabling efficient generation of indels.In this study,we used epiCRISPR system to express paired gRNAs,deleting a DNA fragment for efficient frame shift mutations.HDACs is a gene family of histone deacetylase that regulates cell proliferation.We have got the homozygous knockout of HDAC1,HDAC2 and HDAC6 using the epiCRISPR system with paired gRNAs.

关 键 词：CRISPR/Cas9 基因敲除 epiCRISPR 双gRNA 组蛋白去乙酰化酶 纯合敲除致死基因 

分 类 号：Q812[生物学—生物工程]