比较CRISPR/Cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响  

作　　者：邱梅玉 张雪梅 张宁 徐鑫 刘明军 

机构地区：[1]新疆畜牧科学院生物技术研究所,农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室,新疆动物生物技术重点实验室,新疆乌鲁木齐830000

出　　处：《中国畜牧杂志》2024年第5期293-298,338,共7页Chinese Journal of Animal Science

基　　金：新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(2021D04001);新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2022D01B176);第二批天山英才培养计划青年托举人才项目(2023TSYC QNTJ0021)。

摘　　要：为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定CRISPR/Cas9和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个(36.32%)。本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,CRISPR/Cas9编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。

关 键 词：CRISPR-cas9 引导编辑(PE) EGFP基因 FITC-A-Mean Hi-TOM深度测序 

分 类 号：S813.3[农业科学—畜牧学]