生物钟核受体NR1D1在奶牛子宫内膜上皮细胞炎性反应中的作用  

作　　者：郭怡莹 王雪容 杨王浩 曹梦丹 张海森 靳亚平[1,2] 陈华涛 

机构地区：[1]西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100 [2]农业农村部动物生物技术重点实验室,陕西杨凌712100

出　　处：《中国畜牧杂志》2024年第9期304-310,共7页Chinese Journal of Animal Science

基　　金：国家自然科学基金面上项目(32373088);西北农林科技大学大学生创新创业训练项目(X202310712177)。

摘　　要：本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体,以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEND)炎性反应中的作用。使用1μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型,qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化;设计2对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和1对无义序列,退火后分别连接至pCD513B-U6载体构建3个重组质粒,随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒,获得病毒颗粒后用其感染BEND,2μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞,采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1βmRNA的表达变化。结果表明:LPS处理BEND后,IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高,表明BEND炎性反应模型构建成功。同时,LPS处理后,生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高,提示其可能参与BEND炎性反应的调控;成功构建2个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1和sh2,WB结果显示,sh1和sh2均能有效降低NR1D1的表达,其中sh2的干扰效果最好,使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2的敲低细胞系;LPS处理后,炎症因子在sh2细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体,通过转染BEND细胞,筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系,发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用,为后续深入探究NR1D1在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。

关 键 词：奶牛 NR1D1基因 子宫内膜炎 慢病毒 RNA干扰 

分 类 号：S823.7[农业科学—畜牧学]