1型及2型腺相关病毒对视网膜细胞转导效率的比较研究  

Transduction efficacy of recombinant type 1 and type 2 adeno-associated virus in the retinal cells

作　　者：吴继红[1] 张圣海[1] 刘焰[2] 陈霞芳[1] 徐萍[1] 吴小兵[3] 黄倩[1] 

机构地区：[1]上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,200080 [2]上海交通大学附属第一人民医院眼科,200080 [3]中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

出　　处：《中华医学杂志》2006年第40期2841-2846,共6页National Medical Journal of China

基　　金：国家自然科学基金杰出青年项目资助(30325043);科技部973基金资助项目(2004CB518804);上海市卫生局医学领军人才基金资助项目

摘　　要：目的探讨不同血清型的重组腺相关病毒(rAAV)对视网膜细胞的转导效率、基因表达水平以及感染细胞类型的差异,为眼底病基因治疗选择适当的载体提供实验依据。方法采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清型1型(rAAV2/1-EGFP)和2型(rAAV2-EGFP)rAAV感染体外培养的RPE细胞株、原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞和原代培养的成人RPE细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP荧光出现的时间、阳性率及荧光强度。分别将二种不同血清型的rAAV注射到SD大鼠视网膜下间隙,通过荧光体视镜观察眼底出现EGFP荧光的时间、范围、强度和分布特点等。最后通过眼组织切片和免疫组织化学染色观察被AAV感染的视网膜细胞的类型,以及是否有炎症反应和免疫反应。结果流式细胞仪检测rAAV2-EGFP转导体外培养的RPE细胞株后第7、14天时EGFP阳性率分别为13.5%±1.7%和15.6%±0.8%,平均亮度为2.75±0.12和3.80±0.72;rAAV2/1-EGFP转导RPE细胞株后第7和14天时EGFP阳性率分别为1.1%±0.5%和2.0%±0.4%,平均亮度为1.12±0.09和1.75±0.20。rAAV2-EGFP感染活体视网膜后7、14、28、75d和4个月时,视网膜内EGFP荧光面积分别为(5389±211)μm2、(9832±364)μm2、(14454±446)μm2、(20528±648)μm2和(20264±683)μm2;rAAV2/1-EGFP感染活体视网膜后在相同时间点测得EGFP荧光面积分别为(9666±348)μm2、(12160±439)μm2、(19794±621)μm2、(26172±923)μm2、(26022±965)μm2。每相同时间点的两组数据间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论2型rAAV能有效转导体外培养的视网膜细胞和活体视网膜细胞;但在活体视网膜内1型rAAV是一种比2型AAV更为有效的基因传递载体。Objective To investigate the transduction and gene expression of the recombinant adeno-associated viruses （rAAV） of the serotypes 1 and 2 in the retinal ceils. Methods rAAV vectors of type 1 and type 2 encoding EGFP were infected into the cultured retinal pigmentary epithelium （RPE） cells of the line CRL-2302 and primarily cultured retinal neural cells from normal SD rats, and primarily cultured RPE ceils from an adult cornea donor. The cultured RPE cells transduced by rAAV2-EGFP or rAAV2/1- EGFP were harvested at the 7 th and 14 th day after infection to be detected by fluorescence-activated ceil sorter. The onset of EGFP gene expression and EGFP positive rate were detected by flow cytometry and fluorescence microscopy. Then, rAAV2/1-EGFP and rAAV2-EGFP were injected into the subretinal spaces of 32 SD rats to investigate the onset of EGFP fluorescence and its distribution in the fundus in vivo via fluorescence stereosocope. HE staining and immunohistochemistry were used to observe the infected cell type and immune response in the retina. Results The percentage of EGFP positive ceils and mean intensity of EGFP fluorescence in the ceils transduced by rAAV2-EGFP 7 and 14 days after transduction were 13.50% ±1.70% and 15.60% ±0.82% ,and 2.75 ±0.12 and 3.80 ± 0.72 respectively; and the EGFP positive cells and mean intensity of EGFP fluorescence in the cells transduced by rAAV2/1-EGFP were 1.09% ±0.5% and 1.98% ±0.45%, and 1. 12 ±0.09 and 1.75 ±0.2 respectively. The EGFP fluorescence area in the retina were （5389 ± 211 ） μm^2, （9832 ± 364） μm^2, （14 454 ± 446） μm^2, （20 528 ± 648） μm^2, and （20 264 ± 683 ） μm^2 respectively 3 , 7, 14, and 75 days, and 4 month after transduction by rAAV2-EGFP in vivo; In the rat retina transduced by rAAV2/1-EGFP, the EGFP fluorescence areas were （9666 ± 348）μm^2, （12 160 ±439） μm^2, （19 794 ± 621 ） μm^2, （26 172 ± 923 ） μm^2, and （26 022 ± 965） μm^2 respectively 3 , 7, 14, and 75 days, and 4 month after infect

关 键 词：腺病毒科 视网膜 转导效率 

分 类 号：R774.1[医药卫生—眼科]