腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1基因表达  

Adeno-assoclated virus-mediated RNA interference inhibiting expression of Epstein-Barr Virusencoded latent membrane protein 1 and Its biological activity in vitro

作　　者：刘雄[1] 李湘平[1] 彭英[2] 李刚[1] 张宝[3] 李晓华[4] 周立辉[1] 

机构地区：[1]广州市南方医科大学南方医院耳鼻咽喉科,广东广州510515 [2]广州中山大学第二附属医院神经内科,广东广州510515 [3]广州市南方医科大学分子生物教研室,广东广州510515 [4]南昌解放军第九四医院耳鼻咽喉科,江西南昌330002

出　　处：《中国耳鼻咽喉头颈外科》2006年第11期762-765,共4页Chinese Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery

基　　金：国家自然科学基金(30471945);广东省科技计划公关项目(2003C30303)

摘　　要：目的构建针对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1，LMP-1）的特异性发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）干扰序列的重组腺相关病毒（recombinant adeno—associated virus，rAAV）载体（rAAV-shRNA—LMP-1），介导其体外表达并鉴定其生物活性。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性shRNA干扰序列，采用分子克隆的方法，将干扰序列及U6启动子插入pAAV-2质粒中，采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-shRNA-LMP-1，测定其滴度及感染效率，RT-PCR鉴定目的基因的抑制效率。结果以rAAV-EGFP5×10^4v．g（virus genome，病毒基因组数）／细胞转染C666-1细胞，转染效率大干95％，PT—PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×10^4v．g／细胞转染C666—1后目的基因抑制效率大于90％。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达，为进-步研究肿瘤基因治疗，尤其是动物实验奠定了基础。OBJECTIVE To construct recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector which mediating specific small hairpin RNA （shRNA） on nasopharyngeal carcinoma Epstein-Barr virus （EBV） encoded latent membrane protein 1（LMP-1） and observe its biological activity. METHODS Design specific interference shRNA sequence on EBV-LMP-1,insert it and U6 promotor into pAAV-2 plasmid, rAAV-shRNA-LMP-1 vector was produced using a helper virus-free system. The rAAV viral genome titer was quantified by Real- Time PCR using Taqman. RESULTS The transfection efficiency was exceed 95% and the expression of target gene was inhibited over 90% assessed by RT- PCR after transfected with rAAV-shRNA-LMP-1 at 5×10^4 virus genome（v.g） /cell. CONCLUSION The expression of LMP-1 can be suppressed effectively by rAAV mediated RNA interference. These findings provide a basis for further research of gene therapy on NPC,especially in vivo.

关 键 词：疱疹病毒4型 人 RNA干扰 鼻咽肿瘤 基因 肿瘤抑制 

分 类 号：R739.63[医药卫生—肿瘤]