诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腺相关病毒载体的构建  

To construct the the rAAV vectot delivery of iNOS mRNA antisense

作　　者：杨卫忠[1] 陈春美[1] 王春华[1] 石松生[1] 黄勇[1] 李青[1] 罗望池[1] 蔡冬生[1] 

机构地区：[1]福建医科大学附属协和医院神经外科,350001

出　　处：《福建医药杂志》2008年第1期84-87,共4页Fujian Medical Journal

基　　金：福建省教育厅科技计划项目(JA04200)

摘　　要：目的应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAV-AsiNOS)。方法应用RT-PCR技术扩增iNOS目的基因片断,EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶分别双酶切pAAV-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,住T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化。结果从SD大鼠脑缺血区域中扩增的iNOS特异性片段大小分别为361bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAV-AsiNOS;PCR鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsnNOS目的基因产物特异性片段大小为593bp;基因测序结果显示iNOS基因片段分别反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAV-AsiNOS;经测算病毒原液的滴度为(6～12)×107个/ml,对PC12细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,均约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素。结论成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断分别反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够传染PC12细胞,转染率为70%。Objective To construct the the rAAV Vector （rAAV-AsiNOS） delivery of iNOS mRNA antisense. Methods Gene sequences of iNOS was replicated by RT-PCR. After their construction, the rAAV vectors （rAAV-AsiNOS） was packaged in 293 cells in culture and then purified, concentrated, and titrated. Results The rAAV-AsiNOS was successfully constructed. The titer of virus preparations was （6～ 12） ×10^7/ml and the infection rate was up to 70%. The peak fraction of rAAV preparations contained a concentration of 2× 10^10 viral particles per milliliter excluding influential factors. Conclusions The rAAv-AsiNOS was constructed successfully. PC12 cells could be transfected with rAAV vectors and the transfection rate was up to 70%.

关 键 词：腺相关病毒载体 诱导型一氧化氮合酶 分子克隆技术 

分 类 号：R346[医药卫生—基础医学]