拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段表达载体的构建与鉴定  

作　　者：何静[1,2] 李力[1] 张玮[1] 黎丹戎[1] 王琪[1] 唐步坚[1] 

机构地区：[1]广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科,南宁530021 [2]四川省肿瘤医院妇瘤科

出　　处：《广西医科大学学报》2009年第5期690-693,共4页Journal of Guangxi Medical University

基　　金：广西卫生厅重点项目基金资助项目(No.200514)

摘　　要：目的:构建拓扑异构酶ⅡαRNA小分子干扰片段(TopoⅡαsiRNA)的真核表达载体并进行表达鉴定。方法:(1)根据GeneBank表达序列标签(Esr)数据库设计4对TopoⅡα基因siRNA的小分子片段。(2)采用RT-PCR方法检测细胞中的To-poⅡα表达并确定受试细胞。(3)将最佳沉默siRNA片段克隆到psilencer4.1-CMV-neo载体上,质粒DNA直接测序确定克隆成功。(4)采用脂质体法将TopoⅡα-siRNADNA转染至受试细胞。并采用有限稀释法和G418加压筛选并培养稳转及对照细胞。(5)分别采用RT-PCR和Westernblot方法测定稳转及对照细胞系TopoⅡαmRNA和蛋白表达。结果:(1)SKOV3/DDP细胞中TopoⅡαmRNA表达最高,与其亲本细胞SKOV3相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)以TopoⅡα-4302siRNA片段沉默TopoⅡαmRNA表达最强(P<0.01)。(3)重组阳性克隆经测序鉴定证实TopoⅡα-4302siRNA克隆成功。(4)RT-PCR和Westernblot检测结果显示转染TopoⅡα-4302siRNA质粒DNA后能抑制SKOV3/DDP细胞中的TopoⅡα基因表达。结论:成功构建psilencer4.1-CMV-neo-TopoⅡα-siRNA重组表达载体并稳转至SKOV3/DDP细胞系。为下一步探讨TopoⅡα基因在卵巢癌多药耐药中的作用提供了实验基础。

关 键 词：TopoⅡα基因 RNA干扰 真核表达 构建 卵巢癌 多药耐药 

分 类 号：R737.4[医药卫生—肿瘤]