融合蛋白GST-Ulp1p在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定  

Expression and characterization of soluble recombinant Ulp1p with glutathione S-transferase tag in Escherichia coli

作　　者：傅俊华[1] 王琪[1] 尹杰超[1] 刘铭瑶[1] 李宁[1] 姚文斌[1] 任桂萍[1] 李璐[1] 李德山[1] 

机构地区：[1]东北农业大学生命科学学院生物制药实验室,哈尔滨150030

出　　处：《生物工程学报》2010年第6期837-842,共6页Chinese Journal of Biotechnology

基　　金：国家自然科学基金(No.30700591)资助~~

摘　　要：利用基因工程技术,体外重组小分子类泛素修饰蛋白酶1(Ulp1)的活性片段,获得高表达、高特异性重组蛋白酶。从酿酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1编码第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段(Ulp1p),在其C端加入6×His并连接到大肠杆菌表达载体pGEX中,构建重组表达质粒pGEX-Ulp1p-his6。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。表达、纯化后,以SUMO融合蛋白检测其活性。经过优化,该蛋白可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40.12%。可通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱或Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到纯度98%的蛋白。经酶切分析,比活力为1.375×104U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6无需切除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,具有很高的活性,制备简易;6×His标签,有利于底物蛋白切割后纯化,减少蛋白损失。本研究为制备高活力的SUMO蛋白酶提供了一个新方法。The aim of the study is to obtain an efficient expression of recombinant ubiquitin-like specific protease 1 （Ulp1） by gene engineering.We cloned the Ulp1p,active fragment （403 aa-621 aa） of Ulp1,from Saccharomyces cerevisia,and subcloned into pGEX/Rosetta （DE3） to form an expression plasmid,pGEX-Ulp1p-His6.In order to enhance the solubility of GST-Ulp1p-His6,we purified the fusion protein GST-Ulp1p-His6 by either glutathione S-transferase agarose or Ni-NTA resin chromatography,the purity was up to 98%.We utilized the protein to cleave the SUMO fusions,and the specific activity of GST-Ulp1p-His6 was 1.375×10^4 U/mg.This study showed that the recombinant protein GST-Ulp1p-His6 displayed high specificity and activity.

关 键 词：SUMO蛋白酶1(Ulp1) 谷胱甘肽S-转移酶(GST) 高效表达 活性鉴定 

分 类 号：Q78[生物学—分子生物学]