血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究  

Regulatory effect of serum starvation on autophagy in a human keratinocyte cell line HaCaT

作　　者：陈旭[1] 徐松[1] 张孟丽[1] 黄丹[1] 任发亮[1] 鞠梅[1] 李新宇[1] 陈岜[1] 顾恒[1] 郭新云[2] 金慧[2] 周之海[2] 邢美春[3] 杜开和[3] 

机构地区：[1]中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所,南京210042 [2]天津医科大学总医院皮肤科 [3]南京师范大学

出　　处：《中华皮肤科杂志》2013年第11期815-819,共5页Chinese Journal of Dermatology

基　　金：国家自然科学基金面上项目（81171513）;江苏省基础研究计划（自然科学基金）面上项目（BK20131064）：2011年度高等学校博士学科点专项科研基金（20111106110041）;2013年度北京协和医学院协和青年科研基金（3332013058）

摘　　要：目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应，初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬，分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成，使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升，电镜观察和MDC染色发现，血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示，血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ，LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较，t=13．32，P〈0．01）；自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011，t=7．27，P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中，roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048，t=7．58，P〈0．05；磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020，t=13．77，P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬，并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。Objective To evaluate the regulatory effect of serum starvation on autophagy in human HaCaT keratinoeytes, and to investigate its molecular mechanism. Methods HaCaT cells were cultured either in Dulbeeeo＇s modified Eagle＇s medium （DMEM） ＋ 10% fetal calf serum （control group） or in DMEM without fetal calf serum （starvation group）, for four hours. Then, cell appearance was observed by light microscopy, methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was performed to evaluate cell viability, transmission electron microscopy to observe ultrastruetural changes, monodansyleadaverine （MDC） staining to identify the formation of autophagosomes, and Western blot m measure the expression of mierombule-assoeiated protein 1 light chain 3 （LC3）-Ⅱ, LC3- I and autophagy related protein 7 （ATG7）. Additionally, the phosphorylation level of mammalian target of rapamyein （mTOIR） at Ser2a48 and Ser2481 was semiquantitatively analyzed by Western blot. Results Serum starvation increased the viability of HaCaT cells. Electron microscopy and MDC staining confirmed the formation of autophagosomes in serum-starved HaCaT cells. Compared with the control cells, the serum-starved HaCaT cells showed a significant increase in the transformation of LC3- I to LC3-Ⅱ （LC3-Ⅱ/LC3- Ⅰ ratio： 3.508 ± 0.415 vs. 0.538 ± 0.038, t = 13.32, P 〈 0.01）, and expression of ATG7 （ATGT/GAPDH ratio： 0.048 ± 0.011 vs. 0.021 ± 0.006, t = 7.27, P 〈 0.05）. The phosphorylation level of roTOR at set2448 and ser2481 was significantly lower in the serum-starved HaCaT cells than in the control eells （phosphorylated roTOR （ser2448）/mTOR ratio： 0.394 ± 0.048 vs. 0.762 ± 0.108, t = 7.58, P 〈 0.05; phosphorylated mTO1R （set2481）/mTOR ratio： 0.111 ± 0.020 vs. 0.263 ±0.039, t = 13.77, P 〈 0.05）. Conclusion Serum starvation can induce autophagy in and increase the viability of HaCaT cells, likely by inhibiting the activation of mTOR.

关 键 词：角蛋白细胞 自噬 细胞 培养的 

分 类 号：R363[医药卫生—病理学]