重组人隐花色素蛋白Ⅰ的表达纯化及其在制备放疗保护剂中的应用  

Expression, purification of recombinant human cryptochrome Ι and its application in preparation of protective agent for radiotherapy

作　　者：姚辰[1,2] 盛春姐 刘冬[1] 高诗娟[1] 姜威[1] 余虹燕 李建东[1] 陈慧明[1,2] 武娇祥 潘长穿[4] 陈帅[1] 黄文林[1,3,5] 

机构地区：[1]中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室,北京100101 [2]安徽大学生命科学学院,安徽合肥2306013 [3]中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室,广东广州51006 [4]四川省肿瘤医院.研究所肿瘤内科,四川成都614000 [5]广州达博生物制品有限公司广东省肿瘤靶向治疗新药研发企业重点实验室,广东广州510663

出　　处：《生物工程学报》2015年第1期135-146,共12页Chinese Journal of Biotechnology

基　　金：国家重点基础研究发展计划(973计划)(Nos.2012CB518900,2011CB504706,2011CB504805);国家自然科学基金(No.81171572);"重大新药创制"科技重大专项(No.2014ZX09101041);广东省创新科研团队计划(No.2009010058)资助~~

摘　　要：放疗是治疗肿瘤的最常用手段之一,为寻找能够保护肿瘤组织周边正常细胞的放疗保护剂,通过原核表达质粒的构建,利用大肠杆菌BL21(DE3)诱导并成功表达出人隐花色素蛋白Ⅰ(h CRY1)。采用包涵体溶解、梯度透析复性、镍柱亲和纯化以及超滤浓缩的蛋白纯化工艺,1 L菌液可收获10-15 mg纯度超过95%的h CRY1。在Ha Ca T细胞中通过细胞DNA损伤修复中所产生的H2A.X foci荧光强度的定量检测,验证了纯化所得的h CRY1具有射线损伤防护功能;通过对经过h CRY1以及对照蛋白处理后的细胞凋亡情况的检测排除了h CRY1的毒副作用对H2A.X foci荧光强度的影响。这些为进一步研究h CRY1提供了便利条件,也为将h CRY1开发成为新的放疗保护剂提供了理论基础。<正>1中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室,北京1001012安徽大学生命科学学院,安徽合肥2306013中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室,广东广州5100604四川省肿瘤医院·研究所肿瘤内科,四川成都6140005广州达博生物制品有限公司广东省肿瘤靶向治疗新药研发企业重点实验室。Radiotherapy is a treatment for cancer with undesired by-effects. In order to develop a new radiation protective agent that could reduce the by-effects, we tried to express and purify human eryptochrome 1 （hCRY1）. The coding sequence of hCRY1 was inserted into prokaryotic expression plasmid pET28a（＋）, and this protein was purified from Escherichia coli BL21（DE3） after IPTG induction, ultrasonication, inclusion body dissolution, gradient dialysis, nickel column purification and ultrafiltration. The yield of hCRY1 in 1 L E. coli culture （LB medium） was about 10-15 mg. The radiation protective efficiency of hCRY1 was monitored by detecting X-ray-induced H2A.X foci in HaCaT cells. The results of immunofluorescence show that hCRY1 significantly reduces X-ray stimulated DNA damage response. The apoptosis of HaCaT cell was also detected, and the repression of H2A.X loci formation was not due to hCRYI＇s cytotoxity. All these data suggest a potential application of recombinant hCRY1 as a protective agent for radiotherapy.

关 键 词：生物节律 包涵体 梯度透析 镍柱亲和纯化 DNA损伤 免疫荧光 

分 类 号：R730.55[医药卫生—肿瘤] Q78[医药卫生—临床医学]