短小芽孢杆菌耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达及其酶学特性  

Alkaline-adapted beta-mannanase of Bacillus pumilus:gene heterologous expression and enzyme characterization

作　　者：唐嘉婕[1,2] 郭苏[1,2] 王伟[1,2] 魏巍[1,2] 魏东芝[1,2] 

机构地区：[1]华东理工大学生物工程学院,上海200237 [2]华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237

出　　处：《微生物学报》2015年第11期1445-1457,共13页Acta Microbiologica Sinica

基　　金：中央高校基本科研业务费专项资金(WF1214047);国家自然科学基金(C050203-31200596);国家高技术研究发展计划(2013AA102109);国家自然科学重大项目(2012ZX09304009)~~

摘　　要：【目的】本研究报道了一种新颖的耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达并研究其酶学特性,为其工业应用奠定基础。【方法】通过基因同源性分析以及染色体步移技术,从短小芽孢杆菌Nsic-2中克隆得到甘露聚糖酶基因(manB)。然后分别将manB基因在大肠杆菌BL21(DE3)和枯草芽胞杆菌WB800N中进行表达,并研究其酶学特性。【结果】克隆得到的manB基因序列有一个含1104 bp的开放阅读框,编码一种含有367个氨基酸的甘露聚糖酶(ManB)。经预测其蛋白序列N末端有一个含有31个氨基酸的信号肽。将ManB的氨基酸序列进行同源性分析,发现其与来源于短小芽孢杆菌CCAM080065的甘露聚糖酶具有很高的一致性,可以推测ManB属于糖苷水解酶家族26。manB基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达,得到甘露聚糖酶最高酶活为11021.3 U/m L。与其它甘露聚糖酶比较,ManB在碱性条件下表现出较高的稳定性,在p H6.0-9.0之间酶活相对稳定。纯化后的ManB比活可达4191±107 U/mg。酶反应动力学参数Km和Vmax分别为35.7 mg/m L和14.9μmol/(m L·min)。同时,在枯草芽胞杆菌WB800N中也成功地实现了重组蛋白ManB的分泌表达。【结论】β-甘露聚糖酶基因成功实现异源表达,并得到其酶学性质。本文是首次报道从臭豆腐卤液中分离菌株,克隆表达甘露聚糖酶,并描述其酶学特性。ManB在碱性条件下的酶活稳定性,使得其在工业应用中具备较高的潜在应用价值。[ Objective] We expressed a novel alkaline-adapted beta-mannanase gene and characterized the enzyme for potential industrial applications. [ Methods] We obtained a mannanase gene （named mans） from Bacillus pumilus Nsic- 2 and expressed the gene manB in Escherichia coli and Bacillus subtilis. Furthermore, we characterized the enzyme. [Results] The gene manB had an open reading frame of 1104 bp that encoded a polypeptide of 367-amino-acid beta- mannanase （ManB ）. The protein sequence showed the highest identity with the beta-mannanase from B. pumilus CCAM080065. We expressed the gene manB in E. coli BL21 （DE3） with the enzyme actiVity of 11021.3 U/mL. Compared with other mannanases, ManB showed higher stability under alkaline conditions and was stable at pH6.0 - 9.0. The specific activity of purified Mans was 4191 ± 107 U/mg. The Km and V values of purified ManBwere 35.7 mg/mL and 14.9 μmol/（mL·min） , respectively. Meanwhile, we achieved recombinant protein secretion expression in B. subtilis WB800N. [ Conclusion ] We achieved heterologous expression of the gene manB and characterized its enzyme. The alkaline-adapted Mansshowed potential value in industrial applications due to its pH stability.

关 键 词：短小芽孢杆菌 Β-甘露聚糖酶 基因克隆 酶学特性 枯草芽孢杆菌表达 

分 类 号：Q936[生物学—微生物学]