二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响  

Cisplatin resistant effects ofdihydrofolate reductase gene expression up-regulation in epithelial ovarian cancer

作　　者：李状[1] 王琪[1] 张玮[1] 阳志军[1] 李力[1] 

机构地区：[1]广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科暨区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室,南宁530021

出　　处：《中华妇产科杂志》2015年第11期854-860,共7页Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology

基　　金：国家自然科学基金（30960404）;国家高技术研究发展计划（012AA02A507）;广西科学研究与技术开发计划（桂科攻1140003A-34）

摘　　要：目的探讨二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达上调对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞顺铂耐药的影响。方法构建携带DHFR基因的重组慢病毒载体（即重组载体DHFR—pWPI），利用脂质体lipofectamine2000将其转染至卵巢癌细胞系SKOV3细胞中。实验分为3组：转染组（转染重组载体DHFR-pWPI质粒）、阴性对照组（转染慢病毒载体pWPI质粒）、空白对照组（未转染任何质粒）。（1）蛋白印迹（western blot）法检测3组SKOV3细胞中DHFR蛋白的表达；（2）流式细胞仪检测3组SKOV3细胞经不同浓度（2．5、5．0、10．0、20．0μg／ml）顺铂作用不同时间（24、48、72h）后的细胞凋亡率，以及经3组细胞各自的50％抑制浓度（IC50;分别为6．0、4．0、4．9μg／ml，下同）的顺铂作用不同时间（24、48、72h）后的细胞周期比例；（3）高效液相色谱法检测3组SKOV3细胞经不同浓度（4．0、6．0、8．0μg/ml）顺铂作用不同时间（24、48h）后其细胞内顺铂浓度的变化；（4）透射电镜观察3组SKOV3细胞经各自的IC，。的顺铂作用不同时间（24、48、72h）后细胞超微结构的变化。结果本研究成功构建携带DHFR基因的重组载体DHFR—pWPI并转染入SKOV3细胞。（1）westernblot法检测显示，转染组细胞中DHFR蛋白表达水平为10．280±0．009，明显高于阴性对照组及空白对照组（分别为2．050±0．003、3．480±0．003；P〈0．01）。（2）流式细胞仪检测显示，不同浓度（2．5、5．0、10．0、20．0μg／m1）的顺铂作用24、48h后，转染组细胞凋亡率均明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）；而顺铂浓度为5．0、10．0μg／ml作用72h后，转染组细胞凋亡率则明显高于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48h时，其细胞均以G0／G1期细胞为主，且转染组GJG。期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组�Objective To investigate the effects of dihydrofolate reductase （DHFR） gene expression up-regulating on cisplatin resistance in epithelial ovarian cancer cell lines. Methods The cDNA length of DHFR gene was amplified by PCR and was connected to lentiviral ＇vector pWPI, the recombinant retroviral vector DHFR-pWPI was infected SKOV3 cells by lipofectamine 2000. The groups included DHFR-pWPI-SKOV3 cell, pWPI-SKOV3 cell and SKOV3 cell group. Western blot was used to detect the expression of DHFR. Flow cytometry was applied to measure the cell apoptosis rate of 3 groups cells in different cisplatin concentrations （2.5, 5.0, 10.0, 20.0 ~g/m]） and at different time period （24, 48 and 72 hours）, and half maximal inhibitory concentration （IC50） treated with cisplatin concentration （6.0, 4.0, 4.9 p,g/ml）. High performance liquid chromatography （HPLC） was applied to test intracellular cisplatin concentration in different cisplatin concentration （4.0, 6.0, 8.0 [xg/ml） at 24 and 48 hours. Transmission electron microscope was used to observe uhrastructural changes cells under ICs0 cisplatin concentration. Results The recombinant plasmid DHFR-pWPI was constructed and then infected into SKOV3 cell successfully. （1） The expression of DHFR detected by western blot in transfection group, was higher than those in the negative control group and blank control group （10.280＋0.009 vs 2.050＋0.003 vs 3.480-＋0.003; P〈0.01）. （2） Treated with cisplatin concentration （2.5, 5.0, 10.0, 20.0 p^g/ml） at 24, 48 hours, the apoptosis rate detected by flow eytometry results shown that they were lower than those in the negative control group and blank control group （P〈0.05）, while treated at the concentration of 5.0 and 10.0 μg/ml for 72 hours, whose apoptosis rate in transfection group was higher than those in the negative control group and blank control group （P〈0.05）. When treated cells under IC50 eisplatin concentration （6.0, 4.0, .4.9μg/ml） at for 24 and 48 hours, the results

关 键 词：卵巢肿瘤 抗药性 多药 抗药性 肿瘤 二氢叶酸还原酶 基因表达调控 

分 类 号：R737.31[医药卫生—肿瘤]