DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究  

Functional Split Intein Selected by DNA Display System

作　　者：林森珠 陈格飞[1,2] 孟清[1] 

机构地区：[1]东华大学生物科学与技术研究所,上海201620 [2]卡罗林斯卡学院老年痴呆研究中心,瑞典斯德哥尔摩14157

出　　处：《中国生物化学与分子生物学报》2016年第10期1121-1131,共11页Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology

基　　金：上海市科委攻关项目(No.14521100700);上海市科委国际合作项目(No.14520720200);国家外专局"高端外国专家项目"(No.GDW20143100071);国家自然科学基金面上项目(No.31570721);教育部直属高校学校特色项目(No.TS2011DHDX025)资助~~

摘　　要：蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。Splicing efficient of intein is relied to the neighbouring extein. Previously established Kan selection system is not suitable for spilt intein directed selection,which hinders the application of split intein. To develop a platform for split intein in vitro function selection,we proposed a DNA display system. In this system,streptavidin-fusion protein（ C fragment of split intein-extein-streptavidin） linkedwith their encoding biotinylated gene to form a DNA-protein conjugate in each man-made cell. Only those who can conduct trans-splicing with the N fragment of intein fusion protein（ Flag tag-N fragment of split intein） can be labeled by flag tag,selected via Anti Flag antibody M2 agarose and then be enriched.Here,two gene,IRC（ gene with functional intein） and IRCM（ gene with disabled intein）,were designed to further conform the practicability of this system. By Western blot and DNA electrophoresis analysis system,we found that the in vitro transcription and translation system can express the designed gene（ IRC and IRCM）（ ~ 500 aa）. In this system,intein from positive control（ IRC） still holds it splicing ability,streptavidin fusion protein linked with encoding biotinylated gene with highly efficient（ 95%） and DNA-protein conjugate with functional intein can be enriched. Furthermore, we successfully enriched positive gene（ IRC） from the negative gene（ IRCM） by a factor of 10 fold after two round of selection with an initial ratio R0（ IRC∶ IRCM） = 1∶ 10. Above all,DNA display should be useful for rapidly screening functional split intein in specific extein,which provides a solid fundation for apply intein to biotechnology research.

关 键 词：断裂蛋白质内含子 体外定向进化 DNA展示系统 人工细胞 体外转录翻译系统 

分 类 号：Q78[生物学—分子生物学]